PBJ|TaD27-B基因控制小麥分櫱數

2020-12-05 中國小麥研究聯盟

小麥是我國主要的糧食作物之一，其產量由畝穗數、穗粒數和千粒重決定。分櫱數在一定程度上決定了最終的畝穗數並進而影響產量。在模式植物擬南芥和水稻中，獨腳金內酯(SLs)作為一類植物激素可以抑制側枝的生長。然而，在小麥中，SLs的生物合成和轉運中的調節基因以及這些基因是否參與小麥分櫱知之甚少。DWARF27（D27）基因編碼一種含鐵的β類胡蘿蔔素異構酶，參與SLs的合成。為更進一步理解SLs調控小麥分櫱的分子機理，本研究主要對TaD27-B基因的生物學功能進行了研究，具體結果如下：

1.TaD27s的結構分析

小麥TaDWARF27s（TaD27s）具有三個等位基因TaD27-A、TaD27-B、TaD27-D。利用胺基酸序列比對技術構建了植物D27蛋白系統發育樹，同時利用GSDS網站構建了不同物種D27的內含子-外顯子基因結構圖。結果顯示，幾乎所有D27基因的結構都是由七個外顯子和六個內含子組成（除Triticum urartu外），並且每個外顯子長度大致相同，說明D27基因結構在進化過程中具有很強的保守性。

2.TaD27s的表達模式分析

為檢測TaD27-A、TaD27-B、TaD27-D在小麥植株不同部位的表達量，我們根據它們基因中的差異序列設計了各自的特異定量引物。對KN199小麥的幼根、三葉一心時期的腋芽、單稜期的分生組織、幼葉、小穗原基進行TaD27-A、TaD27-B和TaD27-D表達水平的定量檢測。結果顯示TaD27-A、TaD27-B、TaD27-D基因在小麥的各個組織中均有表達。原位雜交結果顯示TaD27s在小麥的幼葉、分生組織、腋生分生組織、小穗原基中均有表達（圖1b）。亞細胞定位分析顯示TaD27-B蛋白定位於葉綠體上（圖1c）。

3.TaD27-B轉基因植株表型分析

考慮到TaD27-A、TaD27-B和TaD27-D序列同源性極高，且TaD27-B在葉和腋芽中表達水平最高，因此選取TaD27-B為重點研究對象。構建了TaD27-

B-RNAi 和TaD27-B-OE的表達載體。與野生型KN199相比，在返青期、拔節期和成熟期TaD27-RNAi T3代株系的分櫱數目均有不同程度的增多，而TaD27-B-OE T3代株系分櫱數目均有不同程度的減少（圖2,3）。此外，通過統計發現，TaD27-RNAi和TaD27-B-OE轉基因植株株高、每穗粒數、千粒重與野生型相比均沒有顯著變化。

圖1 TaD27s的表達模式分析及TaD27-B蛋白的亞細胞定位。

圖2 TaD27-RNAi小麥植株表型分析。（a-c）野生型KN199和TaD27-RNAi幼苗在返青期（a）、拔節期（b）和成熟期（c）的分櫱表型。紅色箭頭表示分櫱。（d-f）柱狀圖顯示了野生型KN199和三個獨立TaD27-RNAi轉基因株系在返青期（d）、拔節期（e）和成熟期（f）分櫱數的統計分析。（n = 30）。（g）野生型KN199和三個獨立TaD27-RNAi轉基因株系株高統計分析。（h）KN199、48#、50#和55#苗期植株中TaD27s的表達水平分析。單星、雙星和三星號代表t-檢驗中野生型和T3代TaD27-RNAi轉基因植物之間的顯著差異，P<0.01。

圖3 TaD27-B-OE小麥植株表型分析。（a-c）野生型KN199和TaD27-B-OE幼苗在返青期（a）、拔節期（b）和成熟期（c）的分櫱表型。紅色箭頭表示分櫱。（d-f）柱狀圖顯示了野生型KN199和三個獨立TaD27-B-OE轉基因株系在返青期（d）、拔節期（e）和成熟期（f）分櫱數的統計分析。（n = 30）。（g）野生型KN199和三個獨立TaD27-B-OE轉基因株系株高統計。（h）KN199、31#、59#和92#苗期植株中TaD27s的表達水平分析。單星和雙星號代表t-檢驗中野生型和T3代TaD27-B-OE轉基因植物之間的顯著差異，P<0.01。

4. TaD27-B參與獨腳金內酯的合成

列當種子只有在獨腳金內酯化學信號物質或者萌發刺激物質（獨腳金內酯類似物GR24）的誘導下才能萌發，為探究TaD27-B轉基因小麥中獨腳金內酯含量的變化，提取不同株系TaD27-B轉基因小麥的根部提取液並進行了列當處理萌發實驗。實驗結果顯示，去離子水處理的對照中，列當種子萌發芽率為0%，而在列當標準萌發刺激物GR24處理的對照中，列當的萌發率達到了100%。KN199根部浸提液列當萌發率約為40%，TaD27-RNAi轉基因小麥三個獨立株系的根部浸提液列當萌發率均明顯低於野生型KN199；而TaD27-B-OE轉基因小麥三個獨立株系的浸提液列當萌發率明顯高於野生型KN199。該結果表明，與野生型相比，TaD27-RNAi轉基因小麥SLs的含量可能有所減少，TaD27-B-OE轉基因小麥SLs的含量可能有所增加。同時水培條件下，TaD27-RNAi轉基因小麥的腋芽生長速度明顯加快，而TaD27-B-OE轉基因小麥的腋芽生長速度明顯減慢。外源施加獨腳金內酯類似物GR24及其抑制劑TIS108分別可以恢復TaD27-RNAi和TaD27-B-OE的腋芽表型(圖4)。以上實驗結果說明TaD27-B很可能通過參與SLs的生物合成調控小麥腋芽的數目。

5. TaD27-RNAi腋芽轉錄組分析

為了進一步分析小麥分櫱發生的分子基礎，選取3周齡TaD27-RNAi的腋芽進行了RNA-seq分析，以同一發育階段野生型KN199的腋芽為對照。測序結果顯示，許多基因參與到小麥SLs信號通路中共同調控小麥腋芽發育，例如生長素合成及信號轉導基因。基因共表達網絡分析顯示19個轉錄因子與TaD27-B關係更為密切，研究結果為下一步探索小麥分櫱調控的機理奠定了基礎。

一直以來，小麥分櫱基因的發掘與功能鑑定要比很多作物複雜。鑑於禾本科物種間的保守性，小麥中可能具有與水稻保守的基因功能或調控網絡。考慮到小麥基因組是水稻基因組的40倍，重複序列多，我們認為一些重要基因的功能雖然保守，但具體表型和對發育的影響可能具有物種特異性，其調控機制在進化過程中也可能會發生改變。我們的研究結果也很好的證明了這一點。水稻d27突變體植株矮小, 而我們的研究結果TaD27-B表達量的表達量變化並未明顯影響株高。此外TaD27-B轉基因株系的穗部性狀也未受影響，暗示TaD27-B在小麥遺傳改良方面具有良好的應用潛力。

圖4（a）用去離子水，GR24和野生型（KN199），TaD27-RNAi，TaD2-B-OE的根提取物處理列當種子10天後的萌發率。去離子水和GR24分別是陰性和陽性對照。（n = 3）。（b）KN199和TaD27-RNAi三個獨立的轉基因株系的腋芽。標尺= 1 mm。（c）KN199和TaD2-B-OE三個獨立的轉基因株系的腋芽。標尺= 1 mm。

2019年7月27日Plant Biotechnology Journal雜誌在線發表了山東農業大學生命科學學院張憲省教授課題組這一研究成果（TaD27-B Gene Controls the Tiller Number in Hexaploid Wheat，DOI:10.1111/pbi.13220）。課題組已畢業碩士生趙玢和武亭亭同學為該論文的共同第一作者，王芳副教授和張憲省教授為通訊作者。該項研究得到了國家轉基因專項、山東省自然科學基金重大基礎研究等項目資助。

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