作者：龔普陽、顧健
2019年12月以來，中國湖北省武漢地區發現新型冠狀病毒感染的肺炎患者，隨後疫情開始迅速蔓延全國。截至3月8日24時，據31個省（自治區、直轄市）和新疆生產建設兵團報告，累計報告確診病例80 735例，現存重症患者5 111例。世界衛生組織將其列為國際關注的突發公共衛生事件，並將新型冠狀病毒感染的肺炎命名為「COVID-19」（coronavirus disease 2019）。國際病毒分類委員會將新型冠狀病毒命名為「SARS-CoV- 2」，具有傳播迅速、傳染性強、人群普遍易感等特點，並以發熱、乏力及乾咳等作為臨床主要症狀，重症患者則出現呼吸困難、呼吸窘迫症候群及膿毒性休克等。目前，臨床尚未出現針對SARS-CoV-2的有效且特異性藥物與疫苗，西醫主要採用傳統的抗病毒藥物進行治療，其不良反應較大且一定程度上缺乏循證依據。中醫具有整體觀與辨證施治的優勢，對該類疫病的認識悠久歷史，積累了一系列行之有效的治療方法。在國家衛生健康委發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行）》（以下簡稱《診療方案》）第三版至第七版中，中藥處方與成方製劑對不同時期COVID-19患者的應用均取得良好的臨床療效。
金花清感顆粒是在2009年北京地區H1N1流感流行期間，北京市中醫藥管理局組織中西醫學專家攻關論證，參考《傷寒論》《瘟疫論》《溫病條辨》等中醫經典古籍中的百餘個處方，借鑑臨床專家成果，歷經反覆篩選並優化而成。金花清感顆粒組方來源於銀翹散和麻杏石甘湯方的加減，由金銀花、石膏、炙麻黃、知母、連翹、苦杏仁、黃芩、牛蒡子、薄荷、青蒿、浙貝母、甘草共12味藥材組成，具有疏風宣肺、清熱解毒之功效。組方藥味以苦寒藥為主，可用於外感時邪引發的發熱，惡寒輕或不惡寒，咽紅腫痛，咳嗽或咳而有痰。在《診療方案》第四版至第七版中，均將金花清感顆粒作為對處醫學觀察期中具有乏力伴發熱症狀的推薦中成藥。據張伯禮院士介紹，目前已開展的關於金花清感顆粒治療COVID-19的2項研究表明，該方對於輕度及普通型患者療效確切，主要體現在退熱時間、症狀、核酸轉陰時間及炎症吸收方面，且有效控制輕症患者的轉重率。因此，採用生物信息學手段，對金花清感顆粒防治COVID-19潛在的化學與生物學特徵進行初步分析，可為該方進一步的實驗研究與二次開發奠定基礎。網絡藥理學是運用系統生物學、高通量篩選、網絡分析及網絡可視化等多種技術，揭示「疾病-基因-靶標-藥物」相互作用複雜體系，從整體性與系統性的角度探析藥物對機體疾病網絡的幹預與影響。基於藥物與藥物之間結構、功效等方面的相似性，結合機體靶標分子、生物效應的複雜相互作用關係，通過構建藥物-藥物、藥物-靶標等網絡，可有效預測藥物功能或特定功能所對應的藥物，是目前中藥藥效物質基礎研究的重要手段之一。分子對接技術是一種基於受體大分子三維結構與配體化合物的結合作用，通過計算物理化學參數評價二者間的相互作用，從而達到輔助藥物篩選的目的，現已廣泛用於基於特定靶標的中藥及複方活性成分研究。本研究採用網絡分析結合分子對接技術，探討金花清感顆粒中抗COVID-19的潛在物質基礎與作用機制，以期為金花清感顆粒防治COVID-19提供科學依據與臨床應用參考。
1 材料
本研究材料為資料庫與數據分析軟體，其中資料庫包括中藥系統藥理學資料庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/）、靶點蛋白資料庫UniProt（https://www.uniprot.org/）、基因功能與信號通路富集分析資料庫DAVID（https:// david.ncifcrf.gov/home.jsp）、RSCB蛋白質結構資料庫PDB（https://www.rcsb.org/）、小分子化合物結構查詢資料庫PubChem（https:// pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）；分析軟體包括網絡拓撲分析軟體Cytoscape 3.2.1、分子對接軟體AutoDock Vina、Open Bable GUI、Sybyl及數據可視化軟體Graphpad Prism 8、Discovery Studio及在線繪圖站Omishare（http://www.omicshare.com/ tools/index.php/）。
2 方法
2.1 金花清感顆粒中活性化合物及靶標蛋白的篩選
通過TCMSP，以金花清感顆粒中所含11味藥材為關鍵詞檢索其化學成分。以口服生物利用度（oralbioavailability，OB）及類藥性（drug like，DL）為指標進一步遴選各藥味中化學成分[16]。其中，篩選金銀花、炙麻黃、石膏、苦杏仁、黃芩、連翹、浙貝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷化合物中符合OB≥30%且DL≥0.18的化學成分、甘草符合OB≥50%且DL≥0.18的化學成分作為活性成分，並下載相關化合物的靶點信息。
2.2 靶標蛋白基因名的確定及「成分-靶點」網絡的構建
通過UniProt資料庫查找相關靶標蛋白的基因名，將查詢到的靶點蛋白名稱轉化為相應基因簡稱，將藥物與成分和成分與靶點數據導入Cytoscape 3.2.1軟體中，將2個網絡合併構建「藥材-成分-靶點」網絡。
2.3 靶點的通路分析
為探究靶標蛋白信號轉導途徑與功能，將篩選得到的金花清感顆粒潛在作用靶點導入DAVID資料庫，通過輸入靶基因名稱列表並限定物種為人，進行GO生物學過程和KEGG信號通路富集分析，選取前20個條目，並用Graphpad軟體和在線繪圖站Omishare將其結果繪製柱狀圖與氣泡圖進行可視化。 2.4 「成分-靶點」的分子對接
首先，從RSCB蛋白質結構資料庫（PDB）中下載SARS-CoV-2 3CL水解酶的晶體複合物（PDB ID：6LU7）和血管緊張素轉化酶II（ACE2）的晶體複合物（PDB ID：1R42）用於分子對接研究[16]，再運用Discovery Studio軟體對靶蛋白中進行修飾，移除其中的配體和非蛋白分子（如水分子等），保存為pdb格式文件，並利用OpenBable GUI軟體將其轉化為pdbqt格式文件。從PubChem資料庫獲取小分子化合物的2D結構，並利用Sybyl軟體對其進行能量優化，並利用Open Bable GUI軟體將其轉化為pdbqt格式文件。最後，運用AutoDockVina對其進行分子對接，結合能小於0說明受體與配體間可以自髮結合，研究選取結合能≤−5.0 kcal/mol的活性成分作為金花清感顆粒治療COVID-19靶點的篩選依據。
3 結果與分析
3.1 活性成分的篩選
通過TCMSP檢索到金花清感顆粒中11味藥材（生石膏除外）的化合物共計1817個，其中金銀花含236個，麻黃含363個，苦杏仁含113個，黃芩含143個，連翹含150個，浙貝母含17個，知母含81個，牛蒡子含144個，青蒿含126個，薄荷含164個，甘草含280個。金銀花、麻黃、苦杏仁、黃芩、連翹、浙貝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷篩選出活性成分（OB≥30%且DL≥0.18，無靶點蛋白的化合物刪除）共157個，其中金銀花17個，麻黃22個，苦杏仁16個，黃芩32個，連翹20個，浙貝母5個，知母12個，牛蒡子5個，青蒿19個，薄荷9個。篩選甘草活性成分42個（OB≥50%且DL≥0.18）。
3.2 「藥材-成分-靶點」相互作用網絡
「藥材-成分-靶點」網絡中共包括441個節點（11種藥材節點、154個化合物節點、276個靶點節點）和2 235條邊。其中一個節點的度值代表網絡中與節點連接的路線數目。通過拓撲學性質中的中心度值（betweenness centrality）、親中心度值（closeness centrality）和等級值（degree）3個因素篩選網絡中較大的節點進行分析，進而確定關鍵的化合物或者靶點。
從化合物角度分析，有18%的化合物作用靶點≥20個，其中作用靶點≥30個的化合物有22個，通過分析化合物-靶點的中心度值、親中心度值及等級值等發現，排名前10位的化合物分別為MOL000098、MOL000422、MOL000006、MOL000173、MOL000358、MOL000392、MOL004328、MOL002714、MOL004373、MOL000449，分別能與140、57、54、41、36、34、33、33、32、28個靶點蛋白發生作用。從靶點的角度分析，有7.6%的靶點相互作用的化合物大於30，其中作用靶點≥40個化合物的靶點有13個，排名前10的靶點為PTGS2、HSP90AB1 HSP90AA1、PTGS1、NCOA2、AR、NOS2、PRSS1、SCN5A、ESR1、DPP4分別能與123、100、82、75、72、69、65、62、59、55個化合物發生相互作用。
3.3 GO及KEGG靶點通路富集分析
通過採用DAVID中GO富集分析得到GO條目（P＜0.05），包含192個生物過程（biological process，BP）條目、36個條目涉及細胞組成（cellularcomponent，CC）、50個分子功能（molecular function，MF）條目，主要涉及ATP結合、轉錄因子活化、炎症反應、細胞凋亡進程調控等與肺損傷相關生物作用。
KEGG通路富集分析篩選得到127條（P＜0.05）信號通路，涉及膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌及T細胞受體通路等，其中B型肝炎通路涉及E2F1、TNF、MMP9、ELK1、NFKBIA、CXCL8、FASLG等基因；膀胱癌通路涉及E2F1、EGFR、ERBB2、MMP9、TP53、CXCL8、RB1等基因；前列腺癌通路涉及E2F1、HSP90AB1、ERBB2、NFKBIA、PTEN、CTNNB1、AKT1等基因；胰腺癌通路涉及PIK3CG、E2F1、EGFR、RELA、ERBB2、TP53、BCL2L1等基因；小細胞肺癌通路涉及PIK3CG、E2F1、PTGS2、RELA、TP53、NFKBIA、RB1等基因；非小細胞肺癌涉及AKT1、EGFR、E2F1、PIK3CG、PRKCA、MAPK1、CCND1等基因；T細胞受體通路涉及PIK3CG、IL4、TNF、RELA、NFKBIA、IL10、AKT1等基因；選P值較小的20個通路進行可視化。
3.4 金花清感顆粒中核心化合物作用於SARS- CoV-2 3CL水解酶和ACE2的分子對接
一般認為配體與受體相互作用的親和力越強，所需能量越少，其發生作用的可能性越大。分子對接的結果顯示，將金花清感顆粒在「藥材-成分-靶點」網絡中的中心度值、親中心度值及等級值綜合排名前10位的活性化合物及5種臨床治療藥物與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2分別進行分子對接。這些化合物與2個酶之間的親和能均低於5.0 kcal/mol，表明金花清感顆粒中的核心活性化合物與這兩個酶均有較好的結合活性。其中，與SARS-CoV-2 3CL水解酶親和能較低的化合物分別為山柰酚（親和能為−7.8 kcal/mol）、黃芩素（親和能為−7.7 kcal/mol）和木犀草素（親和能為−7.5 kcal/mol）。與此同時，這些化合物與ACE2的親和能均低於−7.0 kcal/mol，與已報導的文獻相符，且其與蛋白之間的相互作用也已報導。此外，與兩個蛋白之間親和結合能較低的化合物還包括豆甾醇、脫水淫羊藿素、β-谷甾醇和芒柄花黃素，為了進一步研究這些化合物與蛋白之間的相互作用，對這4個化合物與蛋白之間的相互作用進行進一步分析。
4 討論
我國至少有3 000年的疫病歷史，自《史記》記載公元前243年「天下疫」開始，共發生大疫500餘次。歷經在實踐中不斷探索與深入，中醫對於疫病的認識和診治，總結了大量的臨床用藥經驗，形成了針對疫病獨特且完備的理論體系。近代以來，中醫藥在乙型腦炎、SARS、H1N1流感等重大疫情防控中發揮重要作用，驗證並建立了一系列的行之有效的診療方案並沿用至今。自武漢COVID-19疫情暴發流行以來，我國先後頒布7版《診療方案》，此外全國28個省市自治區也相繼發布地區方案，在相關疫苗研製相對滯後，特異性藥物缺乏的情況下，中醫藥已逐漸從過去疫情防控的參與者變為疫情治療的主力軍。COVID-19屬於中醫的「疫病」範疇，病因多歸於「溼或溼熱之邪」為主，其核心病機集中於「寒、溼、熱、瘀、閉、虛」等證候要素。初期以「解毒袪邪」為主，後期以「扶助正氣」為主，總體的治療原則以「疏表透邪，宣肺肅降，通腑瀉濁，理氣活血」，使得陰陽匯通，陰平陽秘。
金花清感方是針對甲型H1N1流感治療的方劑，由具有2 000多年治療發熱性傳染病用藥經驗的「麻杏石甘湯」與具備200多年治療溫熱疫病的「銀翹散」調配組合而成。該方在治療流感風熱犯肺證的雙盲隨機對照臨床試驗中，可降低患者退熱時間及退熱率，改善以發熱、頭身疼痛、咽紅咽痛為主症的中醫臨床證候表現，提高病毒轉陰率，且證實在常規劑量治療下安全有效。從臨床表現來看，H1N1流感以「熱毒」為主，COVID-19以「溼毒疫」為主，二者雖然病機病因不同，但發熱是其同性特徵。在金花清感顆粒藥理作用研究方面，其可降低流感病毒肺炎小鼠模型的死亡率，延長生存時間，並減少肺組織病變。在本方組成藥味中，金銀花、連翹、甘草、黃芩等多種藥材提取物與成分具有抗流感病毒或呼吸道合胞病毒作用。金花清感顆粒作為《診療方案》所推薦中成藥，其解熱與抗病毒雙重作用能有效改善COVID-19患者的臨床症狀。因此，本實驗採用網絡藥理學及分子對接技術，進一步對金花清感顆粒中潛在的活性成分進行挖掘，並探討其可能的作用機制。
網絡藥理學分析結果顯示，金花清感顆粒中主要活性成分和綜合評分最高的10個化學成分中有8個黃酮類及2個甾醇類化合物。將10種化學成分分別與SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2進行分子對接，顯示其結合能力均優於臨床推薦用化學藥瑞德西韋、洛匹那韋及利託那韋，並與利巴韋林相近，進一步證實了網絡藥理學的成分篩選結果。綜合對兩種酶的結合能力，表明金花清感顆粒中芒柄花黃素、豆甾醇、β-谷甾醇、去甲脫水淫羊藿黃素為潛在的抗COVID-19活性成分。網絡藥理學所預測的排名前3的靶點分別為PTGS2、HSP90AB1、HSP90AA1。結合現有報導與KEGG分析結果，顯示與肺炎相關的信號通路主要有TNF、PI3K/Akt等，涉及病毒、細菌、免疫調節及炎症反應等多方面生物效應。金花清感顆粒中關鍵成分是否可通過作用於PTGS2、HSP90AB1、HSP90AA1調節相關通路達到改善COVID-19作用仍需相關實驗研究進一步證實與探討。 目前，由於對SARS-CoV-2開展相關體內外研究所需實驗條件的限制，採用大數據網絡分析及虛擬輔助藥物設計對抗COVID-19藥物進行初步篩選顯示一定的技術優勢。已有學者採用該類方法對中藥方劑抗COVID-19的活性成分進行預測。通過總結已有報導發現，雖然藿香正氣口服液、達原飲、清肺排毒湯、抗病毒顆粒等一線臨床用藥在藥味組成上具有差異，而對其所預測篩選得到的抗COVID-19核心化合物中大多存在黃芩素、槲皮素、木樨草素等黃酮類物質。結合本文研究結果，同樣證實了黃芩素、木犀草素等黃酮類成分可能對COVID-19具有藥效作用，除此之外，並進一步發現了去甲脫水淫羊藿黃素、β-谷甾醇和豆甾醇的潛在活性。因此，以多種臨床有效製劑中所篩選得到的共性成分為載體，開展抗SARS-CoV-2相關實驗研究，有利於推動源於中藥的抗冠狀病毒藥物的開發與應用。
綜上所述，本研究基於網絡分析與分子對接技術，以金花清感顆粒為研究對象，對其中所含的化學成分、作用靶標及其關鍵藥效成分與ACE2的結合能力進行分析，初步探索了金花清感顆粒用於防治COVID-19可能的物質基礎與作用機制。本研究可為進一步針對中藥活性成分開展抗COVID-19藥物的篩選和評價提供數據支持和理論依據。
[ 責編：李澍 ]