全新CRISPR/Cas9基因敲入系統助力肝癌建模 | Genome Medicine

全新CRISPR/Cas9基因敲入系統助力肝癌建模 | Genome Medicine

論文標題：CRISPR-SONIC: targeted somatic oncogene knock-in enables rapid in vivo cancer modeling

期刊：Genome Medicine

作者：Haiwei Mou†, Deniz M. Ozata†, Jordan L. Smith†, Ankur Sheel, Suet-Yan Kwan, Soren Hough, Alper Kucukural, Zachary Kennedy, Yueying Cao and Wen Xue

發表時間：2019/04/16

數字識別碼：10.1186/s13073-019-0627-9

原文連結：https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-019-0627-9?utm_source=other&utm_

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最近發表在開放獲取期刊Genome Medicine 上的一項研究，報導了一種建立肝癌小鼠模型的新方法，即利用CRISPR/Cas9系統快速將癌症相關基因敲入小鼠的DNA中。

研究的通訊作者、麻省大學醫學院RNA療法研究所的王文說：「為了更好地理解腫瘤生物學、開展臨床前研究以及為病人找到潛在的治療策略，我們需要有效的腫瘤模型。現有用來敲入致癌基因以建立癌症模型的方法或效率很低，或難以控制敲入位置和敲入的拷貝數。CRISPR/Cas9使得在基因組特定位置——我們將這種位置稱為目標基因座——插入大片段DNA成為可能，並且可應用於實驗室的人類細胞以及小鼠中。我們研發出了一個新的系統——CRISPR-SONIC，可以在肝癌小鼠模型中靈活進行基因敲入，且準確率很高。」

為了解決癌症建模的現存問題、滿足快速有效建立動物模型的需求，牟海偉、Deniz Ozata和Jordan L. Smith研發了這一新系統，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統將致癌基因插入活小鼠的基因組。CRISPR/Cas9系統由一段嚮導RNA和Cas9酶組成。嚮導RNA是一種核苷酸短序列，它會附著到基因組中一個特定的目標DNA序列上。由於嚮導RNA同時也與Cas9酶相連接，它可以將Cas9導向目標DNA序列。然後Cas9會對DNA進行剪切，移除單個核苷酸/整個基因，或在DNA修復過程中插入核苷酸/整個基因。

作者在本研究中使用了具有2個嚮導RNA的CRISPR/Cas9，進行了一個三步驟的操作。首先，其中一個嚮導RNA和Cas9酶一起對目標DNA位置進行切割。第二步，另一個嚮導RNA和Cas9會對一個DNA環（即質粒供體）進行切割，第三步則是將已經被切割成線狀的質粒環插入目標位置。

為了驗證這一方法，作者利用這種方法將一個綠色螢光蛋白（GFP）基因插入了實驗室培養的小鼠細胞中。這個基因在成功進入細胞DNA後，會產生一種在雷射下可見的綠色螢光蛋白，從而表明基因成功插入並被表達。在實驗室細胞中成功檢驗後，作者們在小鼠裡測試了這種方法。

Deniz Ozata說：「我們觀察到在使用了CRISPR-SONIC後，我們的樣本中約有10%的肝臟細胞成功帶上了GFP。這相對於之前那些方法大約0.5%的敲入效率來說，是一個巨大的提升。」

隨後作者們對CRISPR-SONIC系統（包括嚮導RNA、Cas9酶以及一個致癌基因質粒）進行了測試，檢驗它是否可以用來為肝癌中發病率第二的肝內膽管癌進行小鼠建模。

牟海偉說：「導致這種癌症的最常見基因突變發生在抑癌基因TP53（所有病例中約佔26-44%）和致癌基因KRAS（所有病例中約佔16-18%）中。過往研究顯示如果這兩個突變一起發生，可以在小鼠模型中引發肝內膽管癌。我們用CRISPR-SONIC敲入了KRAS，同時加入另一個嚮導RNA敲除了抑癌基因TP53。這在癌症建模中非常重要，因為在p53存在的情況下KRAS無法導致腫瘤的形成。」

將CRISPR-SONIC注射進小鼠一個月後，作者觀察到小鼠肝臟中形成了腫瘤。對照組小鼠在注射了嚮導RNA、Cas9和一段發光DNA片段（而非致癌基因）之後，並未罹患腫瘤。

Jordan L. Smith說：「我們用RAS致癌基因檢測了我們的方法，但我們認為任何致癌基因片段都可以用這種方法定製癌症模型。我們展示了如何利用CRISPR-SONIC建立肝癌模型，但這種方法亦有應用到其他組織和器官的潛力。」

作者還展示了這種方法亦可用於建立生物發光癌症模型，這種模型可以讓研究者們實時監測癌細胞的生長和癌症發展。

摘要：

CRISPR/Cas9 has revolutionized cancer mouse models. Although loss-of-function genetics by CRISPR/Cas9 is well-established, generating gain-of-function alleles in somatic cancer models is still challenging because of the low efficiency of gene knock-in. Here we developed CRISPR-based Somatic Oncogene kNock-In for Cancer Modeling (CRISPR-SONIC), a method for rapid in vivo cancer modeling using homology-independent repair to integrate oncogenes at a targeted genomic locus. Using a dual guide RNA strategy, we integrated a plasmid donor in the 3′-UTR of mouse β-actin, allowing co-expression of reporter genes or oncogenes from the β-actin promoter. We showed that knock-in of oncogenic Ras and loss of p53 efficiently induced intrahepatic cholangiocarcinoma in mice. Further, our strategy can generate bioluminescent liver cancer to facilitate tumor imaging. This method simplifies in vivo gain-of-function genetics by facilitating targeted integration of oncogenes.

閱讀論文全文請訪問：

https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-019-0627-9?utm_source=other&utm_

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期刊介紹:

Genome Medicine(https://genomemedicine.biomedcentral.com/, 8.898 - 2-year Impact Factor, 8.265 - 5-year Impact Factor) is an open access journal publishing outstanding research in the application of genetics, genomics and multi-omics to understand, diagnose and treat disease. Our publication policy combines selection for broad interest and importance with a commitment to serving authors well.

（來源：科學網）

 

 

 

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