糖基化N-聚糖的分析方法、挑戰和展望

蛋白質糖基化是蛋白質肽鏈上添加了單糖或寡糖鏈（聚糖），這是一種常見的翻譯後修飾（PTM），具有多種生物學功能。所有生物藥物中有一半以上是經過糖基化修飾的，包括單克隆抗體（mAb），Fc融合蛋白，凝血因子和細胞因子（例如促紅細胞生成素）。其中，單克隆抗體佔生物治療糖蛋白的比例最大，約佔生物製藥市場的一半以上，隨著生物製藥和生物仿製藥的出現，這種趨勢將持續下去，並有不斷擴大的趨勢。N-糖基化（聚糖與天冬醯胺的氮鏈相連）是生物藥物中，尤其是mAb上最廣為人知的糖基化形式，其中N-聚糖結構會影響藥代動力學、藥效學和免疫原性。糖基化對蛋白質功能的影響意味著糖基化在生物藥物中是產品的關鍵質量屬性（CQA），這使得N-聚糖結構的表徵分析成為生物製藥發展過程中必不可少的部分。N-聚糖結構和糖鏈分支結構的複雜為糖基化分析提出了特殊的挑戰，糖基化分析方法有多種方法，每種方法都有其自身的優點和局限性。在本文中，將對N-糖基化對蛋白質生物學影響進行說明，連同用於闡明蛋白質藥物的N-糖基化特徵的一系列分析技術進行介紹，並討論了糖分析方法未來的發展方向。分子生物學通過DNA、RNA、蛋白質為中心的生物學信息學技術，補充了PTM的全部功能，包括磷酸化，脂化，N-乙醯化，泛素化和糖基化-碳水化合物結構（寡糖）蛋白質形成的糖蛋白。截至2011年，據估計Swiss-Prot資料庫中大約五分之一的蛋白質是糖蛋白。糖基化影響多種蛋白質生物學功能，包括蛋白質摺疊，穩定性和活性。聚糖的結構多樣性使這些變化的功能得以實現，這些聚糖源於單糖結構單元的組成，各種化學鍵合類型和分支。糖基化的最普遍形式是N端糖基化，其中寡糖通過天冬醯胺的側鏈氨基部分（-NH2）連接和O-連接，其中糖通過絲氨酸或蘇氨酸的羥基部分（-OH）連接。生物藥物產品的研究通常最常關注N端糖基化，值得注意的是連接區域上存在的O-聚糖。N-糖基化通常發生在蛋白質包含共有序列基序NXS/T的情況下，其中X不是脯氨酸，儘管在序列的反向序列中觀察到了非共有的N-聯糖基化作用。對於沒有經驗的分析研究人員，N-聚糖分析最初難以理解的糖基化特徵是現在使用的N-聚糖命名法和糖的數量。這可能會使每個分析人員之間把糖基化的相互作用複雜化，因為常見的N-聚糖結構可能會有其他的名稱和圖解。例如，可以說中國倉鼠卵巢（CHO）細胞表達的mAb上最常見的N-聚糖結構是G0F：脫唾液酸，半乳糖，被巖藻糖核心取代的雙複合N-聚糖。這種聚糖也稱為G0，FA2和F（6）A2。後一個名稱使用「牛津」命名法，該命名法具有用於生成聚糖結構圖的相關系統。糖基結構圖的另一個主要系統來自功能糖業聯盟（CFG）。每個都有其優點：牛津結構無需使用文本即可傳達連結類型（α或β）和位置；CFG結構在空間上更緊湊。牛津或CFG結構都可以使用GlycoWorkbench軟體（EUROCarbDB）繪製，本文使用CFG結構表述。抗體及抗體衍生物的N-聚糖N-聚糖對抗體和源自抗體的生物治療劑的功效，穩定性，半衰期和安全性的影響已得到充分研究，並總結在下圖1中。免疫球蛋白G（IgG）分子由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，重鏈在可片段（Fc）區域內的天冬醯胺297處包含一個N-連接的糖基化位點。另外，一些IgG例如cetuximab也被片段抗原結合（Fab）區域內N-糖基化。下圖1A表示IgG Fc區雙鏈N-聚糖的某些治療作用。IgG的Fc區與Fc-γ受體（FcγR）的相互作用通過與FcγRIIIa結合而影響免疫效應功能，包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC），這是一些治療性IgG的作用機理。與Fc N-聚糖的最內層GlcNAc連接的巖藻糖（「核心」巖藻糖）的缺失增強了與Fcγ的結合RIIIa和ADCC活性，與CHO細胞中大多數巖藻糖基化mAb的活性相反。因此，已開發出糖工程學方法來產生具有增強的ADCC活性的巖藻糖基抗體，包括α-1,6-巖藻糖基轉移酶（FUT8）敲除CHO細胞系和巖藻糖基化抑制劑。半乳糖基化還可能通過構象變化來增強FcγRIIIa的結合，並且是巖藻糖基化的ADCC效應的添加劑。末端半乳糖還增加了與補體1q（C1q）的結合，導致增強的補體依賴性細胞毒性（CDC）。末端唾液酸具有抗炎作用，特別是當將α（2,6）連接至半乳糖時，與CHO細胞產生的α（2,3）連接相反。唾液酸殘基的存在也可能會降低ADCC活性。

圖1：生物藥物的N-聚糖結構與功能的關係。（A）N-聚糖結構對Fc和Fc衍生分子的治療作用。（B）N-聚糖結構的免疫原性。ADCC 抗體依賴性細胞介導的細胞毒性；CDC 補體依賴性細胞毒性；NGNA N-糖基神經氨酸。如上圖1B所示，在體外生產的生物治療藥物上可能存在非人類或免疫反應性N-聚糖結構。當半乳糖與半乳糖連接α1,3-時，會形成α-gal表位或Galili抗原，並且該結構不是人類產生的結構。α-gal與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0中產生的對Erbitux（cetuximab）的IgE介導的超敏反應有關，在Fab區中存在α-galN-聚糖。CHO細胞也能夠產生α-gal表位，有趣的是，當Remicade（英夫利昔單抗）和Orencia（abatacept）的FcN-聚糖上存在α-gal時，未觀察到IgE的結合。N-甘氨酸神經氨酸（NGNA或Neu5Gc）是人類未合成的唾液酸，因此具有潛在的免疫原性。下圖2闡述了從完整蛋白質到糖肽鏈，釋放的聚糖，再到單個單糖組成的N-聚糖分析方法。糖蛋白的不同糖型的完整質量可以通過高解析度準確的質譜（HRAM-MS）和反相液相色譜（RP-LC）進行分析表徵。這種「自上而下」的方法需要少量的樣品製備，儘管還原可以用於分別分析重鏈和輕鏈IgG鏈，也可以用特異性蛋白酶（例如IdeS）進行片段化。LC-ESI-MS也已用於分析促紅細胞生成素（EPO）的糖基化，包括darbepoetin alfa，具有兩個額外N-連接聚糖位點和更長血清半衰期的EPO（素樣生長因子;生長因子素;促皮質素;其他多肽激素及衍生物和結構類似物）類似物。

圖2：N-聚糖分析的分析方法。LC =液相色譜；ESI-MS =電噴霧電離質譜；HRAM =高解析度，精確質量；CE =毛細管電泳；FLR =螢光；LIF =雷射誘導的螢光；RP =反相；HPAE-PAD =高效陰離子交換色譜，帶脈衝安培檢測。
為了確定糖基化位點的佔有率，可將糖蛋白與錐蛋白或其他蛋白酶分解為糖肽，並通過LC-MS或CE-MS分析。然而，儘管糖肽分析提供了有關聚糖的組成信息，但它並不能夠提供有關連接和糖鏈分支的結構信息。N-聚糖的分析可通過幾種可釋放N-聚糖的酶來輔助。其中，最著名的是肽N-糖苷酶F（PNGase F），這是一種醯胺酶，通過在N-聚糖的最內層GlcNAc和N-聚糖之間切開而釋放出完整的雙鏈高甘露糖和雜合型N-聚糖。除非GlcNAc被α1,3-巖藻糖基化，否則必須使用PNGaseA。最近，在最新方案中，PNGase F的消化時間從數小時減少到數分鐘，大大縮短了N-聚糖樣品製備流程。PNGase A釋放被α1,3-巖藻糖基化的N-聚糖。還可以使用內切糖苷酶，例如EndoS2，利用該酶在N-聚糖核心中的兩個GlcNAc之間的切割，從而使單個巖藻糖基或巖藻糖基GlcNAc附著在蛋白質上。公開的工作流程描述了將糖苷內切酶EndoS2與IdeS和糖肽分析結合使用以定量測定巖藻糖基化作用。但是，O-聚糖領域不能從可以釋放完整O-聚糖的類似酶中受益。O-糖苷酶（內切-α-N-乙醯半乳糖苷酶）只能從絲氨酸或蘇氨酸中釋放Gal-GalNAc。它不能釋放擴展的O-聚糖結構。O-聚糖的釋放可通過肼解作用或消除β來完成，最近的一項研究為此目的使用了漂白劑。化學釋放也可用於N-聚糖分析，但由於PNGase F的存在，使用較少。釋放的N-聚糖經常用螢光團標記，以增強聚糖的分離和檢測。常用的標記物包括用於LC分離的2-氨基苯甲醯胺（2-AB）和2-氨基苯甲酸（2-AA），也稱為鄰氨基苯甲酸，用於螢光基團的8-氨基萘-1,3,6-三磺酸（ANTS）-輔助碳水化合物電泳（FACE）和1-氨基py-3,6,8-三磺酸（APTS）進行毛細管電泳（CE）。然而，這些染料使用還原胺化化學，這需要加熱孵育。已經開發出包括InstantPC（ProZyme）和RapiFluor-MS（Waters）的螢光基團，它們可以標記PNGase F消化後立即產生的糖胺，從而加快了工作流程，與2-AA和2-AB比較這些染料具有增強的螢光和MS特性。親水相互作用液相色譜法（HILIC）是分離標記N-聚糖的一種廣為接受的技術，超高效液相色譜法（UHPLC）的問世提高了分離度和分離速度。HILIC通常與通過螢光檢測結合使用，從而產生可用於確定樣品中N-聚糖種類的相對豐度的色譜圖。下圖3顯示了一個實例，該實例從Enbrel釋放的N-聚糖被InstantPC標記，並通過HILIC與螢光檢測分離。HILIC也可以耦合到MS以幫助結構識別。根據分離程度的不同，還可以通過以下特徵識別鍵合異構體：具有α（2,3）-唾液酸化作用的N-聚糖比具有α（2,6）唾液酸鍵合的異構化N-聚糖具有更短的HILIC保留時間。標記的N-聚糖也可以在分離前用糖苷酶消化，以促進峰的分離。例如，唾液酸鍵的位置也可以通過唾液酸酶（也稱為神經氨酸酶）的糖苷外切酶消化來確定。肺炎鏈球菌的商業唾液酸酶釋放非還原性末端α（2,3）-連接的唾液酸，尿素節桿菌的唾液酸酶釋放α（2-3,6,8，9）-連接的唾液酸。分離前用鹼性磷酸酶消化聚糖已顯示出鑑定帶有6-磷酸甘露糖（M6P）的聚糖，這是溶酶體靶向酶替代療法的重要聚糖表位。

圖3：用InstantPC標記的Enbrel釋放的N-聚糖，並通過具有螢光檢測功能的親水相互作用液相色譜（HILIC）進行分離。除HILIC外，通過LC分離聚糖的其他選擇包括反相（RP）色譜，混合模式色譜和帶脈衝安培檢測的高性能陰離子交換色譜（HPAE-PAD）。標記有帶電螢光團的N-聚糖可以通過CE進行分離，並通過雷射誘導螢光（LIF），LED誘導螢光（LEDIF）或MS進行檢測。CE的選擇性可用於分析含有α-gal表位的N-聚糖，因為它們比其他中性聚糖和唾液酸化聚糖遷移得更慢。CE的最新發展使得可以通過在Gly-Q上短時間運行或在GlycanAssure和GlyXera儀器上進行多重分析來實現快速分析。這些新平臺與軟體相結合，可幫助進行峰積分，峰調用和確定相對豐度，從而允許在一天內處理許多樣品。最後，通過酸水解將聚糖分解成單糖成分，並用HPAE-PAD分離單糖，可以獲得有關各單糖相對含量的信息，從而獲得聚糖的組成信息。用於單糖分析的其他技術包括將唾液酸與1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯（DMB）偶聯，採用MS的氣相色譜儀（GC-MS）和HPLC。由於糖基化是經常被監測的生物治療藥物的CQA，隨著專利到期的到來以及生物仿製藥的出現，控制過程以提高安全性，功效和產品質量的控制壓力可能會越來越大。糖分析和糖工程技術的進步將是告知研究，開發和生產決策的關鍵。在過去的二十年中，隨著聚糖研究的加速發展，N-聚糖分析有望在三個領域繼續發展：聚糖分離與檢測和數據分析。對於樣品製備，提高分析速度和自動化程度可能會延續最近的發展趨勢，即將製備時間從幾天縮短到幾個小時，生物治療蛋白的酶促片段化和結構域化將提高從一組樣品中獲得的數據水平。美國國家標準技術研究所的NISTmAb等參考標準糖蛋白材料的使用可能有助於統一實驗室中分析糖基化生物療法的方法。同樣，通過LC和CE進行的聚糖分離被設置為在保持或提高分離度的同時加快速度。鑑於樣品製備和聚糖分離的進步，輕鬆分析大量數據的需求將使分析工具成為關注焦點，整個行業和學術界的軟體工程師，計算機科學家，化學家和生物學家都將參與其中。

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