施揚何川Nature聯合發文揭示RNA m6A修飾在DNA損傷反應中的重要...

原標題：施揚何川Nature聯合發文揭示RNA m6A修飾在DNA損傷反應中的重要作用 | 文獻精讀

表觀遺傳學算是生物學裡華人貢獻比較多的一個領域了。比如國外有張毅（發現組蛋白去甲基化酶 JHDM1，哺乳動物 DNA去甲基化）、施揚（組蛋白去甲基化酶 LSD1）、何川等等；國內有朱健康（植物 DNA去甲基化酶 ROS1）、徐國良（哺乳動物 DNA去甲基化）、李恩（ DNA甲基化的建立）等。而且還有下一代的大牛也正在崛起。最近，表觀遺傳越來越熱，前段時間饒毅與朱冰還專門就表觀遺傳進行過相關的辯論。除了DNA甲基化，最近比較熱的就是RNA的m6A修飾了，M6A(N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤)是真核生物mRNA內部序列中最常見的一種甲基化修飾，同時受到甲基轉移酶(METTL3，METTL14，WTAP等)/去甲基化酶(FTO，ALKBH5等)以及一些RNA結合蛋白(YTHDF1/2/3, ELAVL1等)的共同調控，在細胞內是一個動態可逆的過程。在我們之前分享的中也發現m6A對於circRNA的翻譯起著重要作用，而最近施揚與何川強強聯手在Nature發文闡明了RNA m6A修飾在DNA損傷反應中的重要作用。

之前何川曾在Nature Reviews Genetics雜誌上發表綜述，對m6A進行了詳細的介紹。這篇綜述的主要內容分為以下幾個部分：真核生物中的m6A RNA甲基化、真核生物中的m6A「寫入」蛋白、哺乳動物中的m6A「擦除」蛋白、m6A的「讀取蛋白」及效應子功能、m6A的生物學影響。各位感興趣的可以按照文末提示下載原文閱讀。

DNA是生物遺傳信息的重要載體，DNA損傷劑廣泛存在於體內和體外。體內代謝過程產生的自由基和其它活性化合物可以造成DNA損傷；環境中的紫外線和離子輻射以及一些化學物質也可損傷DNA，DNA損傷及時清除或者修復，遺傳信息就能精確保留，如果修復功能有缺陷，DNA損傷就可能造成兩種結果：一是細胞死亡；二是發生基因突變，或進而惡性轉化為腫瘤細胞。

UV照射後DNA分子上的兩個相鄰的胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)之間可以共價鍵連結形成環丁醯環，這種環式結構稱為二聚體。胸腺嘧啶二聚體的形成是 UV對DNA分子的主要損傷方式。

DNA損傷之後細胞會啟動DNA的修復機制，這種機制被稱作DNA損傷反應（DDR）。在本文中作者發現，UV照射會引起DNA損傷位點對應的RNA部位發生快速短暫的m6A修飾。諸多polyA尾的轉錄本都會發生這種修飾，並且受甲基轉移酶METTL3和去甲基酶FTO的調控。當缺失METTL3時，細胞無法迅速修復UV照射引起的突變，並且對UV照射更加敏感，這表明m6A在UV照射引起的DNA損傷反應中有著重要作用。UV照射引起的反應涉及多種DNA聚合酶，其中一些負責重新合成被核苷酸減去修復途徑移除的DNA，另外一些則參與了跨損傷修復從而使得細胞忽略S期的損傷而繼續複製過程。DNA聚合酶κ（Pol κ）與核酸剪切修復途徑也參與跨損傷修復途徑，在METTL3催化下可以快速定位到UV引起的DNA損傷位點。 總之在本文中作者發現了RNA m6A修飾在UV誘導的DNA損傷反應中的重要作用，RNA的m6A修飾主要是指導細胞快速準確的將Pol κ募集到損傷位點並且加速DNA的損傷修復從而促使細胞存活。

為了鑑定DDR過程中涉及的新的染色質調控事件，作者篩查了損傷位點附近的染色質因子和修飾。令人驚訝的是，在U2OS細胞中m6A修飾特異性抗體能很好的識別UV微輻射引起的DNA損傷位點（Fig. 1a）。當進行UVC的全局輻射時，信號主要在細胞核內積累，並且呈現劑量依賴效應（Fig. 1b）。當進行UV照射時，核內信號強度就超過了細胞質，並且在照射後2 min達到峰值，8 min之後減弱。只有UV照射會引起這種反應，而γ射線引起的損傷則沒有誘導m6A修飾（Fig. 1c）。由於DNA和RNA的m6A修飾均可以被m6A修飾抗體識別，所以作者又探索了UV照射到底是引起的哪種修飾。結果發現，當用RNase A處理細胞時，損傷位點的m6A修飾積累消失了（Fig. S1g）。並且實驗表明只有poly(A)+ RNA會與UV照射成劑量相關關係並且在2 min達到峰值（Fig. 1d），而完全RNA則不行，這說明修飾主要發生在poly(A)+ RNA。

接下來作者想鑑定出調控RNA甲基化的酶。而實驗表明，一種已知的m6A甲基轉移酶METTL3可以在2 min內就定位到UV照射誘導的損傷位點處（Fig. 2a），而且敲除實驗發現，METTL3的催化活性是RNA m6A修飾反應的必須條件（Fig. 2b）。因為m6A修飾信號會很快從損傷位點處消失，作者又研究了RNA的去甲基化過程。實驗發現，一種已知的去甲基酶FTO會定位到損傷位點處，當敲除FTO時會增加損傷位點處RNA的m6A修飾，並且當使用UVC照射時，不僅可以增加核內m6A修飾而且可以增加m6A修飾的持續時間（Fig. 2c）。為了增強DDR，之前在細胞中加入了BrdU，不過在沒有使用BrdU的FTO敲除細胞中使用UV照射時也可以發生RNA的m6A修飾，並且在含有BrdU的細胞中用γ射線照射也沒有檢測到RNA的m6A修飾（Fig. 1c）。以上結果說明，m6A修飾反應是UV特異性的，由DNA損傷引起，並且可以通過在DNA中加入BrdU增強。

接下來作者研究了RNA的m6A修飾是否會影響DNA損傷的修復過程。通過使用一個可以識別環丁烷嘧啶二聚體（CPDs，UV照射引起DNA損傷的最初形態）抗體做基因組DNA的dot-blots實驗發現，敲除METTL3時，CPD的移除被延遲了（Fig. 3a）。與此一致的是，METTL3催化活性對於DNA損傷之後的轉錄及時的重新起始也至關重要（Fig. 3b,c）。最後，作者還發現METTL3催化活性對於經過10-15J UV照射的細胞存活也很重要（Fig. 3d）。

DNA聚合酶是DNA修復通路的下遊因子，作者接下來又研究了UV誘導的RNA m6A甲基化修飾是否可以調控他們定位到DNA損傷位點上。結果發現Pol κ定位到損傷位點與RNA m6A修飾同時發生，而且Pol κ是唯一一個招募需要METTL3和METTL4的聚合酶（Fig. 4a），並且依賴於METTL3的催化活性（Fig. 4b）。

總之，本文證實RNA甲基化在促進細胞UV抗性方面的重要作用，並且發現了一個新的通路，這個通路中METTL3、m6A RNA和Pol κ在UV引起的DDR反應早期中起著重要作用，而RNA的甲基化對於將Pol κ招募到損傷位點至關重要（Fig. 4c）。

參考文獻（公眾號對話框回復JC35下載文獻）：

1 Xiang Y, Laurent B, Hsu CH et al. RNA m6A methylation regulates the ultraviolet-induced DNA damage response. Nature 2017; 543:573-576.

2 Fu Y, Dominissini D, Rechavi G, He C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet 2014; 15:293-306.

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