使用非對稱流場 - 流動分級,AF4和光散射探測亞微米蛋白質聚集

光散射儀器廣泛用於表徵溶液中的​​大顆粒和納米顆粒。它提供了使用多角度光散射(MALS)，差示粘度測量，場流分級(FFF)，動態光散射(DLS)，電泳遷移率和確定絕對摩爾質量，大小，構象，電荷和相互作用的尖端工具。成分漸變。

Wyatt在儀器和軟體方面的最新發展使FFF的全部潛力可以為更廣泛的用戶群所用。在這次採訪中，Kim R. Williams和Christoph Johann就新技術及其研究與新聞 - 醫學和生命科學進行了交流。

FFF最突出的特點是什麼?我們為什麼要使用FFF?

首先，我們應該回顧一下FFF最突出的特點。FFF根據尺寸物理分離樣品，因此它允許我們收集餾分。使用Eclipse FFF系統，我們可以將實體從僅幾納米到幾微米的尺寸分開。此外，該技術溫和，施加低剪切力，並且是非破壞性的。

當與MALS結合使用時，FFF特別有效，MALS提供洗脫級分的絕對摩爾質量和大小。因為它結合了基於尺寸的分離和在線光散射，所以它具有比標準批量或未分級DLS更高的解析度。

此外，我認為支持離線方法開發的新SCOUT DPS軟體是一個令人興奮的附加功能。該軟體最大限度地減少了方法開發所需的實驗數量。只需少量注射即可獲得最佳結果，而不是在實驗室中花費數小時。

從FFF實驗中獲得什麼類型的數據?

我們可以從每個洗脫體積的多角度光散射分析中獲得絕對摩爾質量和RMS半徑的詳細分布。此外，我們可以通過動態光散射計算每個洗脫體積的流體動力學半徑，或者從FFF保留時間得出它。

對於大分子，濃度來自UV或折射率檢測器以獲得定量分布，而對於納米顆粒，顆粒濃度的分布僅通過光散射來量化。

您如何確保蛋白質不與AF4膜相互作用？

重要的是要驗證蛋白質與AF4中使用的膜之間沒有相互作用，特別是當AF4用於從保留時間計算粒徑時。

我認為在沒有交叉流動的情況下進行初始運行總是明智的，以確保注入足夠的樣品並且在檢測器中獲得非常大的峰值。如果您發現自己處於完全樣品丟失的嚴重情況，您可以通過降低場強或交叉流速來糾正它。

通過預處理膜，例如通過注入蛋白質溶液，或通過減少鹽負荷，也可以減少相互作用。我發現50毫摩爾氯化鈉溶液，甚至沒有加入鹽的磷酸鹽緩衝液都可以提高FFF的解析度和回收率。您不必總是使用含有150毫摩爾氯化鈉的PBS緩衝液，這在體積排阻色譜MALS中很常見。

你能描述Eclipse FFF嗎？

我認為最重要的是Eclipse FFF易於使用，同時又是一個強大而強大的系統。它結合了三個關鍵特性：無縫集成;完整系統的完全自動化和廣泛的數據處理能力。

能夠使用新的VISION CSH軟體平臺將完整的工作流程從方法開發集成到最終結果非常棒。這包括用於儀器控制和運行實驗的VOYAGER CDS應用程式以及用於數據處理和方法開發的SCOUT DPS應用程式。

我希望我們在儀器和軟體方面的新發展將使更多用戶能夠獲得FFF的全部潛力。

如何使用SCOUT進行方法開發？

SCOUT幫助我們選擇正確的流程程序以實現所需的分離。我們只需要將我們想要的通道幾何形狀和假定的樣品粒度範圍輸入到SCOUT中，建立一個標稱流程序，並且通過它可以直接給出一個預測的分形圖。

流程程序包括通道流速和橫流速率隨時間的演變。預計的峰值立即顯示其計算的保留時間，並且它還給出了峰值稀釋度。我們可以更改參數，例如通道長度或流速，以查看效果。這一切都很快就由軟體決定，為我們節省了大量的實驗時間。

根據我們的經驗，SCOUT預測非常準確，並且緊跟實際實驗的UV痕跡。

通過這種方式，我們可以直接找到一種能夠提供合適解析度的方法。一旦我們選擇了合適的方法，我們就可以將它導出到VOYAGER，它將運行實驗。

FFF如何幫助了解抗體的聚集動力學?分析生物藥物有哪些挑戰?

常規藥物通常是配製成具有長保質期的片劑的膠囊的小分子。相比之下，生物治療藥物或生物藥物是形態上異質的大型複雜分子。

它們在溶液中配製並通過注射器注射或靜脈內輸注施用。與他們的分析相關的主要挑戰源於他們往往不穩定且對壓力敏感的事實。

因此，對我們來說，使用不會使生物藥物降解或變性的分析過程非常重要。有多個加工步驟和應激源可導致不可逆的變性，例如溫度，pH和溶液組成。

如果抗體單體變性，則發生聚集和沉澱，這將在注射入患者時降低其功效並增加其免疫原性的可能性。區分這些蛋白質聚集體和可能的外來汙染物也很重要，例如矽油微滴，氣泡，甚至玻璃碎片或橡膠碎片。

哪種技術可用於表徵蛋白質聚集體?

使用的技術實際上取決於蛋白質的大小。對於超過一微米的蛋白質，存在幾種技術，但是用於分析納米至一微米範圍內的蛋白質的技術非常少。

尺寸排阻色譜(SEC)是目前最常用於觀察蛋白質聚集體的方法，但它並不理想。首先，流動相組成是有限的，這最大限度地減少了柱填料表面上的吸收。其次，可用的孔徑限制了每個柱可以分離的尺寸範圍。

第三，填充柱將導致剪切降解，這在研究瞬態聚集體時尤其成問題。最後，為避免色譜柱堵塞，通常會對樣品進行過濾或超離心分離，並且不知道在此過程中是否清除了哪些樣品。

我們開發了一種基於非對稱流動FFF(AF4)和光散射的簡單方法，以滿足對SEC中丟失物質的信息的需求：較大的聚集體或在柱上經受剪切的聚集體。它使我們能夠獲得亞微米蛋白質聚集體的信息。

您能告訴我們更多關於這種方法的優點嗎?

不對稱流動FFF涉及在沒有填充材料的情況下在開放通道中分離組分。垂直於分離軸施加場以形成交叉流動。使用開放通道可以在很寬的尺寸範圍內進行分離，範圍從1納米到數十微米。然而，我們發現它對於104至大於108道爾頓範圍內的大分子表現最佳。

關於載液的選擇存在很大的靈活性，因為與分離表面的相互作用較少。

此外，我們發現通過調整交叉流速可以輕鬆調整分離，這反過來會改變場強，然後改變保留時間。

當分析100納米及以上的較大分析物(包括抗體聚集體)時，AF4優於尺寸排阻色譜法。

那麼它如何與光散射技術相結合呢?

AF4中的保留時間可以與平移擴散係數相關，該平移擴散係數又可以使用斯託克斯 - 愛因斯坦方程與流體動力學半徑相關。從本質上講，AF4基於流體動力學尺寸實現了分離。

一旦樣品通過AF4進行了尺寸分離，它們就會暴露在在線光散射檢測器中。如果使用多角度光散射(MALS)檢測器，則可以獲得摩爾質量和均方根半徑的測量值。如果使用動態光散射(DLS)檢測器，則可以測量平移擴散係數，由此可以使用斯託克斯愛因斯坦方程計算流體動力學半徑。

AF4和光散射是具有重要協同能力的互補技術。AF4能夠取出多相多分散樣品並將其分離成單分散的部分。然後，MALS和DLS提供摩爾質量和尺寸的正交測量。可以將這些值與使用AF4理論計算的AF4值進行比較。

AF4 MALS如何用於研究蛋白質聚集動力學?

形成蛋白質聚集體有四個基本階段。階段1是與另一種反應性單體的部分展開和可逆締合;第2階段是不可逆的聚集核形成;階段3是鏈聚合;第4階段是聚合凝結。最終結果是形成可溶性高摩爾質量的亞微米物質，這正是我們試圖表徵的

Lumry-Eyring有核聚合(LENP)聚集模型提供了比以前的模型更全面的非天然聚集動力學的定量描述，因為它包含所有這些不同的階段。LENP模型評估三種不同的時間尺度：成核時間(tn);改變聚合的時間(tg);和凝結時間(tc)。

使用一系列微分方程，如果單體分數和聚集體的摩爾質量可以確定為時間的函數，則可以確定tn，tg和tc。這可以通過AF4和MALS實現。

當我們將該技術應用於抗鏈黴抗生物素蛋白IgG1樣品時，我們看到了兩個峰。第一個峰出現在7.5分鐘，這是150千道爾頓單體(相當於抗鏈黴抗生物素蛋白IgG1的摩爾質量)。我們在大約9分鐘後看到的第二個峰值是聚合物。因此，我們設法分離單體和聚集體。

監測這些峰的大小使我們能夠研究應激(例如熱)對被監測蛋白質的影響。沒有加熱，150千道爾頓單體只有一個峰。當施加熱量時，我們看到聚集峰出現並且隨著時間的推移其尺寸增加，因為更多的蛋白質通過暴露於熱量而變性。然後將單體峰的大小作為應力時間的函數作圖。來自AF4-MALS的數據點顯示隨著應力時間增加單體損失增加。然後，從擬合線，我們可以確定tn，tc和tg的值。

通過這種方式，使用AF4和MALS分析，我們已經證明離心樣品是尺寸排阻色譜之前的常見做法，它改變了每個步驟的時間尺度：成核步驟，鏈聚合步驟和聚集縮合步驟。在抗鏈黴抗生物素蛋白IgG1的情況下，該變化不足以改變聚集的動力學。

AF4分離對蛋白質聚集體有何影響?

我們在熱應激後和加入檸檬酸後使用FFF評估了蛋白質聚集體的穩定性。我們可以跟蹤樣本隨時間的變化程度。

我們發現AF4聚焦步驟沒有產生抗鏈黴抗生物素蛋白IgG1聚集體。然而，載體液體組合物確實影響聚集體穩定性，並且在稀釋期間傾向於發生聚集體締合。

AF4中的稀釋主要發生在通道出口處，而不是在分離過程中。與尺寸排阻色譜法相比，這可以為分離濃度敏感的分析物提供更寬容的條件。

AF4和尺寸排阻色譜MALS如何比較蛋白質聚集研究?

尺寸排阻色譜和AF4是基於互補尺寸的分離技術。尺寸排阻色譜法對於小型低聚物具有更好的解析度，而AF4更適合分析高級摩爾質量聚集體，尤其是那些易於產生剪切應力的聚集體。

定性動力學研究表明，AF4甚至可以達到20微米的聚集體，這是尺寸排阻色譜法無法實現的尺寸範圍。

我們相信AF4 MALS可以提供​​動力學機制的重要見解，並能夠研究聚集體的穩定性。