神經幹細胞移植治療脊髓損傷的臨床研究現狀及存在的問題
2020-11-19 來源：中國脊柱脊髓雜誌
作者：南空軍軍醫大學基礎醫學院一大隊一隊 楊昊
脊髓損傷（SCI）是由於外傷、腫瘤、炎症和缺血缺氧等原因引起的脊髓損害，導致SCI患者損傷平面以下功能永久性障礙，嚴重影響患者的生活質量，並給患者家庭和社會帶來沉重經濟負擔，目前尚無有效治療方法，已成為全球性的研究重點和難題。神經幹細胞（NSCs）具有無限增殖的能力和多向分化的潛能，還可以分泌神經營養因子和調節免疫平衡，在動物實驗中已經證實其具有治療SCI的作用，通過移植NSCs或者其分化的產物治療SCI成為有前景的治療策略。然而，儘管臨床試驗在國內外陸續開展，但是國外公開報導的臨床試驗案例非常少，取得的結果也未能達到在動物實驗中出現的預期結果，移植技術存在許多亟待解決的問題。筆者就NSCs移植治療SCI的臨床試驗進展和存在的問題進行綜述，以期為將來NSCs治療SCI的臨床應用研究提供參考。
NSCs的生物學特性
1992年，Reynolds等從成年小鼠腦紋狀體中分離出能在體外不斷分裂增殖且具有多向分化潛能的細胞群，提出了NSCs的概念。NSCs具有多種來源：①胚胎幹細胞（ESCs）源性NSCs，通過對ESCs誘導分化為NSCs；②胚胎源性NSCs，從胎兒腦和脊髓內直接分離獲得的NSCs；③成體腦源性NSCs，從成體腦室下區、海馬和脊髓等部位分離培養出的NSCs；④間充質幹細胞（MSCs）源性NSCs，將骨髓間充質幹細胞（BMSCs）和脂肪間充質幹細胞跨胚層分化為NSCs；⑤誘導性多能幹細胞（iPSCs）源性NSCs，通過誘導iPSCs分化為NSCs。目前臨床試驗中較多使用的是胚胎源性和MSCs源性NSCs。
NSCs是一類具有無限增殖/自我更新和多向分化潛能的多能幹細胞，可分化為所有神經譜系的細胞，包括神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，在胚胎神經系統形成和成年神經再生中發揮重要作用。在體外懸浮培養的條件下，NSCs具有無限增殖的潛力，自我增殖形成克隆球，稱為神經球。無限增殖的特性實現了在體外可將NSCs擴增到移植所需要的細胞數量。NSCs具有良好的遷移功能和組織融合性，在損傷個體中，受病變部位神經源性信號的影響，移植的NSCs向病變部位遷移並分化為神經細胞；同時還分泌眾多不同類型的營養因子、細胞因子等，營養神經和調節免疫平衡，促進神經修復和再生。另外，NSCs處於未分化狀態，具有低免疫原性，有利於異體移植。1999年，McDonald等在大鼠SCI模型中首次證明了NSCs移植治療SCI的潛力。之後大量動物實驗表明，移植不同來源的NSCs都可以分化為神經細胞，促進軸突再生和再髓鞘化，減小脊髓空洞形成和損傷範圍，促進SCI動物的功能恢復。NSCs這些特有的生物學特性，使其成為極富應用前景的治療SCI的候選細胞之一，國內外都在努力嘗試開展臨床試驗。
NSCs移植治療SCI的臨床試驗
開展臨床試驗是將NSCs成功應用到臨床的必經過程。雖然受法律法規和技術等方面的限制，使用NSCs治療SCI的臨床試驗案例非常少，但是依然獲得了一些可供借鑑的有價值的臨床試驗數據。自2005年韓國開展世界首例NSCs移植治療SCI的臨床試驗以來，中國和美國都積極開展了NSCs移植的臨床試驗，主要在NSCs移植安全性方面進行評估，有限的試驗結果初步證實了臨床使用的安全性和耐受性，部分患者伴有部分的功能恢復。所使用的NSCs主要有胚胎源性NSCs、臍血源性NSCs和BMSCs源性NSCs。
胚胎源性NSCs 2005年，韓國延世大學衛生系統世福蘭斯醫院批准了世界首例人胚胎腦組織來源的神經幹/前體細胞（hNS/PCs）移植治療SCI的臨床試驗。臨床前期動物實驗已經證實此株hNS/PCs可以改善SCI大鼠運動功能，移植細胞向損傷處廣泛遷移，大部分保持未分化狀態。臨床試驗中將1億個hNS/PCs分別移植到19例頸段SCI患者的損傷脊髓處，1年後有5例患者症狀得到改善，其中包括肌力恢復和運動功能評分的提高，無神經病理痛惡化或痙攣加重的跡象，無腫瘤形成等不良現象，移植安全，患者耐受良好。此項研究首次通過有限的病例獲得了一些臨床安全性和療效方面的數據，為臨床應用hNS/PCs移植治療頸段SCI提供了安全性和耐受性支持，但還需要更大規模的、可控的臨床試驗進一步證實。
在動物實驗中，通過研究多種NSCs的移植效果，發現有的NSCs細胞株在向神經元方向分化、生存和遷移等方面表現出更加優良的特性。NSI-566RSC細胞株是從人8周胎兒脊髓中分離得到的一株NSCs，因其移植過程中良好的生物學特性被寄予厚望。動物實驗證實此株細胞與大多數NSCs移植後的命運不同，是一種具有良好生長特性和神經發生潛能的細胞株，移植後分化產生大量神經元，與宿主神經元形成突觸，顯著提高脊髓功能恢復，前期細胞實驗和動物移植實驗均未顯示致瘤性，具有很好的臨床應用潛力。2013年美國神經幹細胞公司將FDA批准的NSI-566RSC細胞株應用於臨床試驗中，在加州大學聖地牙哥分校進行Ⅰ期臨床安全試驗，將其移植到T2～T12SCI受試者的脊髓內，觀察療效和安全性。4例患者接受了6次細胞注射共120萬個細胞，所有受試者對手術的耐受性良好，移植後18～27個月沒有發生嚴重的副作用，移植安全；在2例受試者中，運動和感覺功能提高1~2個脊髓節段水平。雖然NSI-566RSC細胞在安全性和耐受性方面取得了積極的結果，但是仍然存在樣本量過少的問題，需要進一步的臨床研究證明其臨床應用價值。
臨床移植中同樣被寄予厚望的還有人中樞神經系統幹細胞（HuCNS-SC）。HuCNS-SC是來源於人胎兒腦組織的NSCs，此株細胞在SCI動物模型中被反覆證明可以移植、生存、遷移、分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，具有良好生物學特性。同時，HuCNS-SC在治療梅茨巴赫病和神經元蠟樣脂褐質貯積症等CNS疾病的臨床試驗中均取得良好的效果。2011年美國幹細胞公司使用HuCNS-SC對12例T2～T11SCI患者進行臨床Ⅰ/Ⅱ期移植試驗，NSCs直接注射到患者脊髓損傷處吻側和尾側，注射2000萬個細胞，分6～8次移植，結果顯示HuCNS-SC移植有很好的臨床安全性與耐受性，而且有7例患者感覺節段有提高；該團隊還在2014年對17例C5~C7SCI患者進行細胞劑量和安全性的Ⅱ期臨床試驗，患者分4～8次接受1500～4000個萬細胞注射，結果顯示，隨著劑量的增加，患者並沒有出現與此相關的不良反應，4000萬個細胞移植組出現的不良反應如腦脊液漏、頭痛、便秘等在3個月後基本消失，證實NSCs移植是安全的，且不同劑量對功能無明顯影響。但是，隨著時間的推移，患者功能改善逐漸變小，儘管比未移植前功能有所提升，但因改善程度小，此項試驗被幹細胞公司終止。
國內同期也在積極開展了NSCs移植的相關臨床試驗。2013年陳文鬥等對13例急性SCI患者進行胎兒來源的NSCs移植治療，第一次靜脈移植1000萬個NSCs，隨後進行5次鞘內注射，每次1000萬個細胞，間隔5d，期間進行針灸等康復訓練，3個月後進行美國脊髓損傷協會（ASIA）評分，患者感覺功能明顯改善，但運動功能改善不明顯。胚胎源性hNSCs移植治療SCI患者發揮作用的機制目前在人體中研究比較困難，但是在臨床使用前，均對使用的胚胎源性hNSCs在動物中做了大量的實驗研究，發現移植的hNSCs可以很好地整合到損傷的小鼠脊髓，通過分化為少突膠質細胞，或者分化為神經元，或者保留NSCs性質不變而發揮作用。韓國首例臨床移植試驗使用的hNSPCs臨床前期實驗證實，移植的hNSPCs21.3%分化為神經元，3.5%分化為星形膠質細胞，1.5%分化為成熟的少突膠質細胞，而超過80%的移植細胞維持在NSCs狀態；移植的hNSPCs表達多種神經營養因子，包括腦源性神經營養因子、膠質細胞源性神經營養因子、血管內皮生長因子等，還有抗炎因子和免疫調節因子，這些因素是促進軸突再生和功能恢復的主要原因。關於NSI-566RSC細胞株的臨床前期實驗證實，此細胞株是一種具有良好生長特性和神經發生潛能的細胞株，移植後分化產生大量神經元，與宿主神經元形成突觸，顯著促進脊髓功能恢復。
臍血源性NSCs 臍血源NSCs是從新生兒臍帶血中分離的MSCs分化而來，具有與胚胎及神經組織來源的NSCs類似的生物學特性，但是比胚胎源性NSCs相對易獲取。動物實驗證實臍血源NSCs能夠改善SCI動物後肢功能。2008年趙寧等向51例SCI患者蛛網膜下腔注射1500萬～6000萬個臍血源MSCs及其分化產生的NS/PCs（包含80%MSCs，20%NS/PCs，由深圳市北科細胞工程研究所提供）；2017年慄昭生等使用同一研究所提供的臍血源幹細胞（包含80%MSCs，20%NS/PCs）分別對102例SCI患者蛛網膜下腔注射1.0~2.0ml細胞（具體細胞濃度未註明）。兩個試驗結果均顯示移植後患者ASIA評分和運動功能評分無顯著性差異，只有感覺功能有略微提升；患者同時出現了發熱和頭痛等不良反應，但均在一段時間後恢復。而且這兩個臨床試驗均缺乏對照組證實單獨移植臍血源NS/PCs的作用。2014年吳月奎等對36例陳舊性SCI患者鞘內注射300萬個新生兒臍血源性NSCs，移植後患者生命體徵平穩，3例患者短暫出現發熱，3個月後ASIA各項評分較前提高、膀胱殘餘尿量減少。這些臨床試驗從NSCs移植的安全性、技術可行性和療效方面提供了初步臨床證據。目前尚無臨床數據探討臍血源性NSCs發揮作用的機制，通過動物實驗分析其可能的機制為：臍血源性NSCs可以增加微環境中神經營養因子的表達，促進軸突再生，抑制脫髓鞘，保護神經元；調節免疫平衡；促進血管新生；可以分化為神經細胞，發揮營養和支持作用。
BMSCs源性NSCs 由於異體移植具有免疫排斥反應，不利於移植細胞的存活，因此，有研究者使用自體BMSCs源性NSCs治療SCI。BMSCs在誘導條件下可以跨胚層分化為NSCs，具有很強的自我更新能力和可塑性；可自身獲得，易獲取，避免了倫理道德和免疫排斥反應等方面的制約，臨床應用潛力巨大。2010年張贊等對9例陳舊性SCI患者分別在損傷的脊髓部位兩側注射2000萬個BMSC來源的NSCs，6個月後，其中7例患者運動、痛覺、輕觸覺均有改善，伴或不伴有AIS（簡明損傷分級）的改善，但是ASIA評分均有顯著提高；同時，部分患者的肌張力、大小便、植物神經功能和性功能也有改善；部分患者出現的發熱、頭暈、頭痛、神經刺激等不良反應均在1~3d消失。2016年段建剛等對35例SCI患者進行BMSC源性NSCs移植，2000萬細胞注射到損傷脊髓部位兩側，6個月後患者的運動、痛覺和輕觸覺等ASIA總評分顯著提高。根據動物實驗推測BMSCs源性NSCs促進脊髓功能恢復的可能機制為：移植細胞會遷移至脊髓缺血區，分化為神經細胞，分泌神經營養因子和免疫調節因子來改善微環境，促進神經元分化，刺激軸突出芽和髓鞘重構，從而促進軸突再生和神經組織修復。
綜上所述，通過有限的臨床試驗，初步發現幾種不同來源的NSCs移植都比較安全，並且對部分SCI患者有一定的療效。但是由於試驗樣本量太少，需要大樣本試驗研究才能得出確定的結論。綜合分析以上臨床試驗可以發現，雖然NSCs移植在SCI動物模型取得了令人鼓舞的進展，但治療效果卻不能在臨床試驗中完美複製，存在很大差距，分析原因主要在於：①NSCs在脊髓內發揮作用的機制不清，臨床無法調控NSCs的生長分化；②患者對移植的NSCs產生免疫排斥反應，不利於NSCs存活，隨時間延長，療效逐漸下降；③實驗動物與人類存在解剖和功能上的差異，例如大鼠是四足動物，脊髓解剖與人類有很多的不同，比如皮質脊髓束位於大鼠的背部，而在人類位於腹側，有可能造成實驗結果的差異；④僅靠單一細胞移植不能解決所有問題，應儘早聯合分子治療和生物材料等手段進一步增強NSCs的功能。
NSCs移植治療SCI的臨床轉化所面臨的問題
NSCs移植距離成功應用到臨床還有很多問題需要解決。除了SCI機制尚未完全闡明，以及NSCs在脊髓內發揮作用的機制尚不完全清楚外，其他的主要局限在於：①移植技術的規範問題，目前尚制定不出最佳的NSCs移植的臨床使用規範；②如何獲得可靠和安全的NSCs；③如何排除致瘤性等移植風險；④如何解決倫理問題。
移植技術規範問題 移植時間的選擇SCI後病情持續發生演變，由急性階段逐漸進入慢性階段，為NSCs移植的最佳時間選擇帶來了困難。一般認為，在慢性期移植，會避免劇烈的炎性反應，提供更適宜的移植環境；而在瘢痕形成之前移植，會更好地恢復損傷的神經環路。儘管在動物實驗開展了相關研究，但是未得到確切結論，臨床試驗更是缺乏針對NSCs最佳移植時間的研究。參考BMSCs的臨床試驗數據發現，關於移植時間的結果非常不一致。比如，Saito等將BMSCs移植入5例亞急性頸SCI患者，結果有2例患者功能改善；而在Kyu等的試驗中，將BMSCs移植入16例慢性頸SCI患者，16例功能均有改善，顯示慢性期移植優於急性期。但也有相反的結果，Karamouzian等將BMSCs移植入11例亞急性胸SCI患者，有5例顯示出功能改善；而Vaquero等將BMSCs移植入12例慢性胸SCI患者，只有4例患者功能改善，提示亞急性期移植優於慢性期移植。因為臨床試驗中患者人群和幹細胞類型的差異，容易造成結果的差異。所以需要開展直接比較SCI後不同時間段的NSCs移植效果的臨床研究。
移植途徑的選擇移植途徑是關乎NSCs是否發揮最佳作用的重要問題，目前主要有三種移植途徑：脊髓局部注射、鞘內注射和血管內注射。脊髓局部注射主要是在損傷脊髓處或周圍注射幹細胞，是SCI臨床試驗中常用路徑。儘管在動物實驗中出現SCI，但臨床試驗表明局部注射是安全的。鞘內注射是利用腰椎穿刺技術，將NSCs注射到蛛網膜下腔，隨著腦脊液流到腦和脊髓，適用於病變範圍較廣的神經系統疾病，也用於SCI，但是在多發性硬化和肌萎縮性脊髓側索硬化的MSCs移植臨床試驗中發現，鞘內注射過程中有發生無菌性腦膜炎的風險。血管內注射是細胞經血液循環到達病變部位發揮作用，該方法操作簡單、創傷小、易被患者接受；但在其他疾病的MSCs臨床移植試驗中發現，經靜脈移植的MSCs有引起局部血管血栓和肺血栓的風險。臨床試驗證實，三種方法在多種中樞神經系統疾病中均有效。每種途徑都有其優點和局限性，因為影響移植效果的變量很多，現在還沒有專門針對NSCs移植途徑做對比研究的臨床試驗，仍需藉助於動物實驗的數據支持，對於SCI患者哪種途徑會取得最佳治療效果尚需更多的臨床對比研究。
移植細胞數量的選擇由於免疫排斥反應、損傷組織炎性和氧化應激環境等不良因素的存在，不利於移植的NSCs存活，而脊髓功能的恢復與移植NSCs的存活量相關，所以移植細胞的存活率是臨床試驗關注的重要問題之一。Ghobrial等將HuCNS-SC移植到5例C5~C7SCI的患者中，1例移植1500萬個細胞，1例為3000萬個，2例為4000萬個，1例為對照組，最後結果顯示，隨著劑量的增加，患者並沒有出現與此相關的不良反應，4000萬個細胞移植組出現的不良反應如腦脊液漏，頭痛，便秘等3個月後基本消失，證實NSCs移植是安全的，且不同劑量對功能無明顯影響。但是通過對多種細胞移植（包括不同類型幹細胞和非幹細胞）的臨床研究的綜合比較分析，包括24項臨床試驗含594例患者，認為對於慢性SCI患者，移植細胞劑量在1000~5000萬個和10000~20000萬個療效更好。然而針對NSCs移植治療SCI細胞數量的選擇需要進一步的臨床試驗摸索。
NSCs來源的選擇 NSCs有多種獲取途徑，不同來源的NSCs具有不同的優缺點。①胚胎源性NSCs和胚胎幹細胞分化的NSCs在動物實驗證實可顯著促進SCI後功能恢復，而且臨床試驗中胚胎源性NSCs如NSI-566RSC株和HuCNS-SC株以及其他胚胎源性NSCs均顯示是安全的，但胚胎源性幹細胞只能從流產胚胎中獲取，受到技術與倫理的限制，並且移植後會發生免疫排斥反應，因此使用受到限制。②成體腦源性與脊髓源性NSCs，因其獲取受到技術與倫理的限制，未得到發展。③MSCs是一種成體多能幹細胞，骨髓和臍帶血具有豐富的MSCs，可分化為多種類型的中胚層組織，近年來證實也可以跨胚層分化為NS/PCs，易獲得，可自身獲取，避免了免疫排斥反應，從倫理上爭議較少，臨床試驗也證明是安全有效的，是目前NSCs移植治療SCI的臨床試驗中的主要來源之一。④iPSC來源的NSCs具有易獲取、可施行自體移植、不發生免疫排斥的優點，但也有動物實驗研究發現有的iPSC來源的細胞具有免疫原性，而且準備時程較長，涉及基因幹預，目前尚沒有臨床試驗報導。在SCI治療的臨床試驗中，目前大多使用胚胎和MSC來源的NSCs進行移植試驗。不同來源的NSCs對臨床移植效果有何不同，尚缺乏臨床試驗對比研究。在進行臨床試驗時應權衡各種細胞優缺點，根據實際情況選擇細胞來源。
移植風險 致瘤風險是NSCs移植面臨的重要問題。雖然目前尚無NSCs移植治療SCI的臨床試驗中出現致瘤案例，但是，曾在人胚胎源性NSCs移植治療共濟失調毛細血管擴張症的臨床試驗中發現其致瘤性，1例13歲共濟失調毛細血管擴張症的男孩，小腦和鞘內移植NSCs，4年後發生來自供體細胞的多發性腦腫瘤。由於機制不清楚，目前尚無有效方法避免致瘤風險。
法律法規和倫理問題 由於hNSCs來源於人體組織，NSCs移植不免要涉及法律法規和倫理問題，如果處理不好，不僅會影響患者的康復，也會阻礙NSCs移植技術的應用和發展。主要存在以下問題：①監督機制不健全。主要表現在醫院層面和國家層面兩級監管機制缺失，在醫院層面缺乏監管機制，不能充分評估幹細胞移植的有效性和危險性，有可能將高危險性NSCs用於人體移植試驗，所以醫院應成立專業的監督部門加強對此類情況的審查；在國家層面由於監管缺陷，幹細胞移植相關法律法規不完善，容易導致監管不力，使未經證實的幹細胞治療合法化。在幹細胞臨床移植試驗開展之前，有必要接受這兩個重要層面的嚴格監管。②患者知情同意的問題。目前，NSCs移植技術的有效性和安全性尚沒有經過確切的臨床驗證，由於存在醫患對醫學知識掌握具有不平等性，在未能讓患者充分了解移植有可能帶來傷害而不是獲益的情況下，醫生容易對患者變相地誘導，使患者同意進行臨床試驗。由於NSCs移植也存在巨大的利益衝突問題，更容易加重不利於患者的情況。隨著NSCs移植研究逐漸進入臨床試驗階段，這些問題應引起足夠重視和完善，才能保證該領域的良性發展。
總結與展望
綜上，NSCs具有多向分化潛能，並能通過分泌營養因子和調節免疫微環境，起到支持和保護的作用，使NSCs移植在治療SCI中展現出誘人的應用前景。雖然已經開展了有限的臨床試驗，但是，NSCs移植技術的有效性尚未在臨床試驗中得到有效證實，存在問題還很多，包括在作用機制、技術規範、移植風險、法律法規和倫理等諸多方面。將NSCs移植應用於臨床還為時尚早。然而，已有的和正在進行的臨床試驗研究將為未來NSCs的臨床應用提供重要的參考價值。基於NSCs特有的生物學特性，隨著各種問題的逐步解決，相信NSCs移植將在治療SCI中發揮重要作用。
來源：中國脊柱脊髓雜誌2020年第30卷第9期
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