研究揭示CRISPR-Cas12a蛋白複合體切割雙鏈DNA的動態調控機制

2019年8月6日，清華大學生命科學學院陳春來研究組在Cell期刊新推出的子刊《iScience》上發表了題為「crRNA和DNA的匹配度對Cas12a蛋白複合體切割雙鏈DNA的動態結構和切割位點的調控」（Conformational dynamics and cleavage sites of Cas12a are modulated by complementarity between crRNA and DNA）的研究論文。該論文利用單分子螢光共振能量轉移技術（single-molecule FRET）直接觀測Cas12a複合體切割過程中動態構象變化，建立了相應的定量動力學模型，並揭示了crRNA和DNA的匹配度對複合體動態結構和切割位點調節機制。

Cas12a蛋白（又稱Cpf1）在哺乳動物的基因編輯中展現出了比Cas9蛋白更高的切割特異性。因此Cas12a切割雙鏈DNA的分子機制受到了研究者的廣泛關注。該研究利用單分子螢光共振能量轉移技術，通過標記在crRNA和DNA上的螢光FRET對，來直接觀測LbCas12a複合體在切割雙鏈DNA過程中的動態構象變化，最終構建的定量動力學模型如圖。首先，Cas12a/crRNA二元複合物識別靶標DNA序列，形成三元複合物，並在PAM序列近端開始形成R-loop（low FRET態）。隨著R-loop的進一步延伸，Cas12a蛋白的核酸酶活性被激活，並且使得非互補鏈（NTS）從雙鏈DNA結構解開，將切割位點暴露出來，以完成NTS鏈的切割（medium FRET態）。斷裂的NTS鏈穩定了Cas12a複合體的互補鏈(TS)切割構象（high FRET態），以完成對TS鏈的切割。

通過以上模型，該研究揭示了Cas12a切割雙鏈DNA過程中的重要分子機制。1）Cas12a結合和切割DNA過程中高度可逆的動態過程是導致其高特異性的重要因素之一；2）非互補鏈（NTS）從雙鏈DNA上解開以暴露其切割位點這一過程，晚於Cas12a核酸酶活性的激活過程，是切割中重要的校驗步驟；3）只有斷裂的NTS鏈，才能穩定Cas12a複合體的互補鏈(TS)切割構象，從而確保了Cas12a利用單個結構域對兩條DNA鏈有序的切割過程；4）Cas12a複合體存在多個互補鏈(TS)切割構象，可切割產生不同長度的產物，而切割構象的相對穩定性受到crRNA和DNA的匹配度的調控。(

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