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2020年1月31日，Cell Press新型冠狀病毒資源中心正式開放。您可以在該資源中心頁面上查找到COVID-19相關論文的投稿政策，以及Cell Press旗下期刊已發表的有關疫情和病毒的論文。網站正在不斷更新中，所有內容都可以免費閱讀。
最新在中心上線的發表在Cell Press細胞出版社旗下期刊Immunity上的研究，名為」 Nanoparticle Vaccines Based on the Receptor Binding Domain (RBD) and Heptad Repeat (HR) of SARS-CoV-2 Elicit Robust Protective Immune Responses」, 來自中山大學人類病毒學研究所的張輝教授團隊基於自組裝的幽門螺旋桿菌鐵蛋白（Ferritin）二十四聚體，開發了針對新冠病毒的新型納米顆粒疫苗。
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研究概述
目前全世界已經開發了多種應對全球COVID-19大流行的疫苗，這些疫苗均通過獨特的方式誘導了一定的免疫反應。為提供更多強力有效的備用疫苗，中山大學人類病毒學研究所團隊基於自組裝的幽門螺旋桿菌鐵蛋白（Ferritin）二十四聚體，開發了針對新冠病毒的新型納米顆粒疫苗。該納米顆粒疫苗可以將新冠病毒S刺突蛋白的受體結合域（RBD）和七肽重複域（HR）通過SpyTag/SpyCatcher系統共價結合於鐵蛋白二十四聚體的表面。通過對小鼠模型和恆河猴模型進行Prime/Boost疫苗免疫，團隊發現相對於RBD或RBD/HR單體，RBD和RBD/HR納米顆粒疫苗可以誘導更加高滴度的中和抗體和更加強烈的細胞免疫反應。納米顆粒疫苗可以完全抵禦免疫後的hACE2小鼠免遭SARS-CoV-2感染。RBD/HR納米顆粒疫苗同時可以促進產生針對其他種類冠狀病毒的中和抗體和細胞免疫反應。團隊對恆河猴進行納米顆粒疫苗免疫還發現，在Boost二次免疫以前，納米顆粒疫苗免疫的恆河猴體內已經產生了高劑量的中和抗體，以及強烈的T細胞和B細胞免疫反應。並且產生的中和抗體和T/B免疫反應可以持續三個月以上。因此，團隊認為基於RBD和HR的新型納米顆粒疫苗可以為抵抗新冠病毒感染甚至其他種類的冠狀病毒感染提供具有研發前景的疫苗接種手段，值得在臨床研究中深入探索其保護機體的價值。
——全體研究團隊
摘要
為應對全球COVID-19大流行，科研人員提出了各種疫苗策略，每種策略引發免疫反應的途徑都十分獨特。在此，我們通過將自組裝的24聚體鐵蛋白與SARS-CoV-2刺突（S）蛋白的受體結合結構域（RBD）和/或七肽重複域（HR）亞基共價結合，開發了一種納米顆粒疫苗。與單體疫苗相比，這種納米顆粒疫苗能誘導產生更強大的中和抗體和細胞免疫反應。接種了RBD和RBD-HR納米顆粒的hACE2轉基因小鼠在受到SARS-CoV-2攻擊後，肺部的病毒載量降低。另外，RBD-HR納米顆粒疫苗接種還能促進針對其他冠狀病毒的中和抗體和細胞免疫反應。恆河猴接種這一納米顆粒疫苗後體內也產生了相應的中和抗體、T細胞和B細胞應答反應，並且這些反應持續超過三個月。因此，基於RBD和HR的納米顆粒提供了一種頗有前景的疫苗接種策略，或能抗擊SARS-CoV-2和其他冠狀病毒。
簡介
大多數SARS-CoV-2感染誘導產生的中和抗體都靶向病毒S刺突蛋白，尤其是受體結合域（RBD）（Jiang et al., 2020; Ju et al., 2020; Pinto et al., 2020; Rogers et al., 2020）。因此，S蛋白是候選疫苗設計中最有希望的靶點（Amanat & Krammer, 2020）。截至2020年11月，超過259種SARS-CoV-2候選疫苗正處於研發過程中，包括54種已進入臨床試驗的候選疫苗（報告來自https://vac-lshtm.shinyapps.io/ncov_vaccine_landscape/）。大多數候選疫苗靶向冠狀病毒S蛋白，主要可分為五種類型：DNA疫苗、mRNA疫苗、載體疫苗、滅活疫苗和蛋白亞基疫苗。這幾種疫苗類型各有優缺點。
儘管有數百種SARS-CoV-2候選疫苗正在研發過程中，它們均未完成並通過三期臨床試驗，從而確保其功效、安全性，以及持久的保護作用。此外，大多數正在進行的疫苗研究無法特異性富集具有高免疫原性的有效抗原。為了克服上述限制並提供更多備選疫苗，我們設計和評估了幾種納米顆粒疫苗，分別將RBD或RBD / HR蛋白亞基共價結合至自組裝的24聚體幽門螺桿菌（H. pylori）非血紅素鐵蛋白。我們在小鼠和恆河猴模型中研究了抗體總量及激發的中和反應，發現基於鐵蛋白的納米顆粒比蛋白亞基單體能夠誘導產生更多的中和抗體。另外，我們發現位於S蛋白S2亞基內的HR亞單位也能夠誘導產生顯著的中和抗體。通過HR亞基與鐵蛋白納米顆粒的結合，中和抗體的滴度進一步提高。
此外，我們還評估了RBD / HR嵌合鐵蛋白納米顆粒的免疫原性。發現RBD納米顆粒疫苗和RBD / HR納米顆粒疫苗均能夠保護遭到病毒攻擊的小鼠免受SARS-CoV-2感染。針對抗體依賴性增強效應（ADE）的分析表明，納米顆粒疫苗引發的病毒特異性抗體不具有ADE。儘管RBD/HR納米顆粒誘導產生的中和抗體效價與RBD納米顆粒相似，但RBD / HR納米顆粒還能夠中和其他冠狀病毒。細胞反應分析表明，基於RBD和（或）HR的納米顆粒疫苗在小鼠和恆河猴中均誘導了更強的CD8 T細胞反應和以Th1細胞為主導的CD4 T細胞反應。總的來說，基於RBD和HR的納米顆粒疫苗顯著增強了免疫原性。
基於RBD和HR的納米顆粒疫苗的構建和純化
由於S蛋白是候選疫苗設計中最有希望的靶點，因此我們比對了哺乳動物冠狀病毒的S蛋白序列，其中包括三種SARS-CoV-2病毒株（SYSU-IHV、USA-IA-6399和Wu-Hu-1），六種人類致病性冠狀病毒（SARS-CoV Tor2、MERS-CoV EMC、hCoV-HKU1、hCoV-OC43、hCoV-NL63和hCoV-229E），五種蝙蝠冠狀病毒，以及兩種穿山甲冠狀病毒。比對結果表明，S2亞基內的七肽重複序列1（HR1）和七肽重複序列2（HR2）在不同的SARS-CoV-2株和不同的冠狀病毒之間高度保守。在冠狀病毒的進化史中，HR1-HR2區域比受體結合結構域（RBD）更為保守。此外，多項研究表明，HR（HR1和HR2）具有許多交叉反應性的SARS-CoV-2 CD4和CD8 T細胞表位，還具有誘導中和反應的潛力（Ahmed et al., 2020; Elshabrawy et al., 2012; Grifoni et al., 2020a; Grifoni et al., 2020b; Mateus et al., 2020; Ravichandran et al., 2020）。特別值得注意的是，我們最近發現，97.9％的COVID-19康復患者體內具有針對HR區的高滴度IgG（Liu et al., 2020a）。為了擴展中和圖譜、增強T細胞反應，並設計出可對抗更多冠狀病毒的通用疫苗，我們選擇RBD和HR作為候選疫苗的靶點。
為了增強基於RBD和HR的疫苗的免疫原性，我們在納米顆粒上集中呈現抗原，並選擇了幽門螺桿菌鐵蛋白（以下簡稱鐵蛋白）作為SARS-CoV-2納米顆粒疫苗的核心。為了提高呈現兩個或多個不同蛋白亞基的能力並增加亞基的產量，我們引入了起源於化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SpyTag / SpyCatcher系統，共價結合至含鐵蛋白的納米顆粒，而不是將二者直接融合（Wang et al., 2020c; Zakeri et al., 2012）。SpyTag（ST）（13aa）在RBD或HR的N端和分泌信號肽（SP）下遊進行基因融合（圖1A）。SP促進了蛋白質的分泌；在基因融合後SP被移除。SpyCatcher（SC）（138aa）在鐵蛋白的N端進行基因融合（圖1A）。ST-RBD、ST-HR和SC-鐵蛋白在其C末端均有6×His-標記，有助於Ni-NTA的親和純化。SC-鐵蛋白通過大腸桿菌進行表達並純化，而ST-RBD和ST-HR均從CHO-S細胞進行表達並純化，從而保留各自的糖基化修飾，這對於疫苗的免疫原性至關重要（Tokatlian et al., 2019; Watanabe et al., 2020）。
為了構建RBD或HR納米顆粒疫苗，我們將每種抗原分別與等摩爾的鐵蛋白一起混合培養。為了構建RBD / HR嵌合納米顆粒疫苗，我們將RBD和HR單體以7:3的摩爾比混合，然後與鐵蛋白一起混合培養（圖1C）。鐵蛋白核心、RBD單體、HR單體及相應的納米顆粒結合物的純度均通過考馬斯亮藍染色和蛋白質印跡法進行了驗證（圖1D）。納米顆粒的純度和均質性也通過SEC和透射電子顯微鏡（TEM）進行了驗證（圖1E和1F）。根據分析，RBD / HR納米顆粒中RBD-鐵蛋白和HR-鐵蛋白的摩爾比保持在7:3。我們發現，僅SC-鐵蛋白核心形成了光滑的二十四聚體球形納米顆粒。在抗原結合之後，RBD-鐵蛋白和RBD / HR-鐵蛋白顯示出從球形核心突出的刺突（圖1F）。通過這種表達呈現策略，我們成功地在納米顆粒中富集了候選抗原。
▲圖1
討論
在本研究中，我們設計和評估了兩種使用鐵蛋白納米顆粒與RBD或RBD / HR亞基偶聯的疫苗。兩種納米顆粒疫苗均能夠誘導大量的RBD或HR特異性抗體。接受納米顆粒疫苗的動物體內產生了RBD特異性抗體，並顯著地中止了RBD介導的hACE2結合。進一步的中和測定表明，納米顆粒疫苗誘導產生的nAb明顯多於單體疫苗誘導的nAb。RBD / HR納米顆粒誘導產生的nAb還能中和其他的冠狀病毒。在受到真病毒攻擊時，高滴度的納米顆粒疫苗誘導的nAb使hACE2-小鼠完全免於SARS-CoV-2感染。
此外，我們發現，與單體疫苗相比，納米顆粒疫苗可誘導更高百分比的細胞毒性CD8 IFN-γ、IL-2和TNF-α。這表明納米顆粒疫苗還能夠激發強烈的T細胞免疫反應，從而清除可能感染的細胞。納米顆粒疫苗引發了強烈的保護性Th1偏向反應，但並未產生可能誘導VAERD的Th2偏向免疫反應。與SARS-CoV-2疫苗的其他研發策略相比，DC和巨噬細胞更容易捕獲和呈遞納米顆粒疫苗。經過消化的抗原接著被呈遞給CD8+ T細胞，後者將誘導產生更多的IFN-γ特異性CD8+ T細胞。於是，納米顆粒疫苗激發了T細胞的快速反應，也誘導分泌了針對RBD和HR的特異性中和抗體 ，並產生了更多的RBD特異性IgG1和IgG2b記憶B細胞。納米顆粒疫苗免疫小鼠體內記憶B細胞的百分比很高，表明納米顆粒疫苗可以誘導持久的體液免疫反應。
另外，納米顆粒疫苗僅需一小部分源自S1或S2的免疫原，而不是全長S蛋白，就可以誘導有效的免疫反應，而且可以最大程度地降低發生ADE的風險。的確，我們在hACE2小鼠模型和恆河猴模型中均未發現ADE的任何證據。這些結果表明我們的疫苗策略或能提高安全性。而且，與其他帶有人工材料的源自納米顆粒的疫苗不同，我們使用的納米顆粒的所有成分均源於自然，並且具有高度的安全性。儘管二十四聚體鐵蛋白核心也誘導產生了鐵蛋白特異性抗體，但RBD或HR特異性抗體的效價並未受到明顯影響。幽門螺桿菌鐵蛋白及其抗體在體內不太可能具有明顯的毒性，因為已經有兩種基於幽門螺桿菌鐵蛋白的流感納米顆粒疫苗完成了臨床評估或正處於臨床評估中（NCT03186781、NCT03814720），並且沒有產生嚴重的副作用。
在本研究中，我們提出的疫苗設計特殊之處是加入了S蛋白S2亞基的HR子域。冠狀病毒之間HR區域的同源性分析表明，在冠狀病毒，尤其是β-冠狀病毒的進化史中，HR是高度保守的。此外，HR還具有誘發中和反應的潛力（Ravichandran et al., 2020）。我們設計的納米顆粒疫苗中包含HR抗原，這使得該疫苗能夠誘導產生大量的HR特異性nAb。HR區域還包含許多交叉反應的SARS-CoV-2 CD4和CD8 T細胞表位（Ahmed et al., 2020;Grifoni et al., 2020a; Grifoni et al., 2020b; Mateus et al., 2020）。交叉中和反應實驗表明，含HR的納米顆粒疫苗誘導的nAbs還能中和更多其他的冠狀病毒，這說明利用HR作為抗原誘導產生的nAb可以提供針對更多其他冠狀病毒的交叉保護。
另外，我們發現，RBD / HR納米顆粒在生發中心內可誘導更高比例的Tfh和B細胞，以及更高比例的RBD特異性IgG1和IgG2b記憶B細胞。由於B細胞成熟依賴於與Tfh細胞的協同作用，HR抗原中的CD4 T細胞表位可能有助於Tfh細胞以高親和力識別和選擇抗原特異性B細胞，從而促進漿細胞的成熟。儘管HR誘導產生的nAb不如RBD誘導的多，但是HR誘導的體液免疫反應和T細胞免疫反應具有交叉反應性，可對抗多種冠狀病毒，這種效應還具有可協調T / B細胞的作用，這為我們未來構建和評估冠狀病毒通用疫苗提供了富有價值的信息。
為了實現針對SARS-CoV-2感染的全面保護，我們迫切需要安全有效的疫苗。本文所描述的RBD和RBD / HR的雙抗原納米顆粒疫苗具有顯著的免疫原性、高保護效率、廣泛的免疫譜，以及潛在的安全性。另外，這些納米顆粒的生產非常便利，可以通過CHO-S細胞或大腸桿菌大規模表達兩至三個蛋白質單元。經過表達和純化後，這些重組蛋白能自動共價結合納米顆粒，而無需任何特殊的酶和緩衝液。此外，該疫苗的製造程序不需要特殊的生物安全環境。因此，這些納米顆粒疫苗值得在I-II期臨床試驗中進行進一步評估。
相關論文信息
原文刊載於CellPress細胞出版社旗下期刊Immunity上
▌論文標題：
Nanoparticle Vaccines Based on the Receptor Binding Domain (RBD) and Heptad Repeat (HR) of SARS-CoV-2 Elicit Robust Protective Immune Responses
▌論文網址：
https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(20)30502-1
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.11.015
Cell Press新型冠狀病毒資源中心
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