作者：朱小兵
一．HbA1c臨床應用基石
自從DCCT（糖尿病控制與併發症試驗）和UKPDS（英國前瞻性糖尿病研究）這兩大臨床研究確立了糖化血紅蛋白（HbA1c）在糖尿病監控中的重要地位後，HbA1c在糖尿病領域的應用越來越廣泛，尤其是2010年ADA（美國糖尿病學會）和2011年WHO（世界衛生組織）將其作為糖尿病診斷指標之一後。雖然，在中國目前還沒有將其作為糖尿病診斷指標之一，但隨著大家對HbA1c的認識以及實驗室檢測質量的提高，其作為診斷指標是遲早的事。
二．變異體對HbA1c的幹擾
作為醫療工作者，尤其是檢驗人員和臨床醫生，對HbA1c的應用應該有很清楚的認識。但對於HbA1c的一些幹擾因素，比如血紅蛋白變異體，卻缺乏必要的了解。而在中國，尤其是南方，血紅蛋白變異體種類和攜帶比例不低。
眾所周知，HbA1c的生成是一個相當緩慢的過程，且在人體內是沒有酶的參與的。其生成量與下列因素相關，1）HbA濃度；2）葡萄糖濃度 3）HbA和葡萄糖作用時間 4）紅細胞壽命。這些影響因素，或者影響這些因素的因素，都會導致HbA1c的結果不能如實評估體內血糖平均水平。其中的第2個因素，大家比較容易理解；第3個因素，也有相關文獻報導，但大家理解深淺不一。至於第1和4個因素，現在也有文獻在關注，但又確實在臨床造成困擾。所以，中華醫學會糖尿病學分會在《中華糖尿病雜誌》中發表的文章《中國2型糖尿病防治指南（2013版）》中指出：對於患有貧血和血紅蛋白異常疾病的患者，HbA1c的檢測結果是不可靠的，可以考慮其他指標，比如血糖、糖化血清蛋白或糖化血清白蛋白來評價血糖。類似的表述也在《中華人民共和國衛生行業標準 WS/T461—2015，糖化血紅蛋白檢測》中出現。為什麼會有這樣的表述？如何理解？
首先，我們先來理解貧血。貧血，在臨床上常見的有兩類，一類是缺鐵性貧血，另外一類是溶血性貧血，比如地中海貧血。而這兩類貧血對HbA1c的影響是不同的，前者可導致HbA1c的結果偏高，而後者是偏低。
而血紅蛋白變異體，對糖化結果的影響，就比較複雜了。
什麼是變異體？其實就是構成血紅蛋白的珠蛋白的肽鏈即α，β或δ組成和正常的有差異。比如血紅蛋白E（HbE），就是β鏈的第26位Glu突變為Lys，其他胺基酸序列不變。到目前為止，全球共發現有超過1239種變異體，僅僅β鏈變異體就有608種以上，且每天都在更新（參見網站http://globin.bx.psu.edu/cgi-bin/hbvar/query_vars3）。其中大多數的理化性質等均不明。血紅蛋白變異體，在中國也有80多種。探討變異體對HbA1c幹擾，可以從兩個層次或角度，即檢測HbA1c準確性和其臨床使用，來考慮。
從HbA1c檢測的準確性角度來考慮，這也是當今很多文獻最關注的地方。大家比較關注當某一標本有變異體時，採用的方法系統報告的HbA1c結果準不準。我們知道，市面上檢測HbA1c的方法，大致可分為兩類，一類是分離法，另外一類是化學反應法。前者包括電泳、離子交換HPLC、毛細管電泳，代表廠家有Sebia和Bio-Rad等；而後者有免疫法，酶法和親和層析法，代表廠家有Roche和Trinity等。分離的方法，能否抗變異體的幹擾，關鍵要看其能否將HbA1c和變異體糖化部分分開，同時將HbA和變異體分開？如果均能，HbA1c的結果本身是準確的。記住，我這裡說的是HbA1c的結果，而不是說其能否應用於臨床！如果HbA1c和變異體糖化部分分不開或HbA和變異體分不開，那麼HbA1c結果就會假性增高或減低。但如果採用了化學反應為基礎的方法，比如親和層析法，本身就不能區分樣板中的變異體和正常的HbA，也不能區分其各自對應的糖化產物。很多此類方法學的廠家宣稱有變異體時，說其對糖化結果沒有影響。這種說法，其實是有很大問題，雖然有一定市場。但如果即使要這樣認定，也一定要告知前提條件，那就是，變異體的糖化速率和HbA的一樣、穩定性也一樣、紅細胞壽命也和正常人的一樣，且變異體的結構變化不會導致化學反應的差異。但變異體種類有那麼多，我們並沒有足夠證據來證明這些前提條件。例如，變異體Hb Raleigh是β鏈N端的第一個胺基酸Val突變為Ac-Ala，而後者是不能進行糖基化反應的。如果用親和法、酶法或免疫法，由於該變異體結構發生變異、糖化速率不一致，得出的HbA1c結果肯定有問題。同時，Rhea J.M等也發現血紅蛋白S，C，D等能導致紅細胞壽命不一。這些均會導致HbA1c的結果不可靠或不能用來評估血糖。由於市場競爭等原因，現在很多廠家都宣稱自己的方法學或系統不受變異體幹擾，真實情況果真如此？在權威的http://www.ngsp.org/interf.asp的網站上，列出了市場上主流的一些品牌對抗血紅蛋白S，C，D，E和F幹擾能力的總結。這些結果，相對來說，比較客觀。同時，關於其他種類變異體，比如更少見的變異體情況，文獻報導不是很多。國際上Little RR在這方面做了很多研究，發表的文獻也很多。2015年Little RR等人用8種方法學，研究了49種變異體的幹擾情況，結果顯示各種方法學的表現是有差異的。該研究是Roche公司資助的，使用Trinity Ultra 2的親和層析以及Roche的免疫法分別作為一級和二級參比系統；同時Tosoh G7/G8，Bio-Rad D10/Turbo，Diazyme酶法，Sebia Capillarys 2 FP作為研究系統。下表1是該文就44種變異體各種方法的結果匯總，因為有5種變異體的結果Roche的和Trinity的不吻合，且沒法從胺基酸替代位置來解釋不一致原因，其數據被剔除。其中Sebia數據比較少的一個原因是本次研究的樣本是凍存過的，有降解，而Sebia系統上會出現一些非典型圖譜結果，無法滿足Sebia廠家結果報告要求。判斷某一系統結果和一級參比系統是否吻合的評判標準是，如該系統結果落在該系統與Trinity用正常樣本建立的回歸曲線99%的置信區間內，則吻合，報告可靠；否則，不吻合，報告不可靠。
表1. 不同系統對有不同種類變異體（雜合子）時可能誤報糖化血紅蛋白結果統計
a. Roche的和Trinity不吻合，且認為Trinity結果可靠
由此表可以看出，1）有變異體時，各種系統可能報告準確或不準確的結果。如有Hb J-Baltimore時，G8的報告，19例有17例報告出錯，G7的無錯報。Bio-Rad的無錯報；2）綜合來說，Bio-Rad的系統表現最好（基於文獻中變異體樣本糖化結果不準確數量，伯樂系統最少，得出的結論），尤其是D10，44種變異體中，無結果有問題。正是由於變異體種類多，各種方法，各種型號表現不一，可能導致糖化結果準確或不準確，這樣臨床醫生就很有必要知曉其使用的檢測系統是否能檢測出變異體（最好知曉是何種變異體），能否抗其幹擾。
從HbA1c的臨床使用角度來說，是因為DCCT和UKPDS這兩大臨床研究的結果證明了HbA1c和平均血糖關係以及與糖尿病併發症發生進展風險關係，我們才可以採用HbA1c來監控血糖水平，進行療效評估等。然而，由於當初的研究中並沒有變異體的相關臨床數據，我們沒法用正常人的數據來指導有變異體的患者臨床診治，尤其是當變異體可能改變紅細胞壽命或結合有地中海貧血時等情況。比如有變異體或地貧時，我們就不能用6.5%作為糖尿病診斷切點。所以，出現變異體或地中海貧血時，我們就有必要限制HbA1c在糖尿病診治中的使用，可以換用其他指標來評估血糖，診治糖尿病。這些觀點，在2015年的《Diabetes Care》雜誌上發表的《2015年ADA糖尿病醫學診療標準》和《中華糖尿病雜誌》上發表的《中國2型糖尿病防治指南（2013版）》均有體現。
三．小結
變異體對HbA1c的幹擾，其實是一個比較複雜的問題。從檢測HbA1c技術本身來說，我們不能籠統地說某一方法學抗變異體幹擾，而應該具體到某一種變異體以及到多高濃度不幹擾HbA1c結果。不幸的是，目前全球還沒有哪一種方法或系統可以做到這一點，哪怕是IFCC推薦的參考方法對此也無能為力。當然，從應用價值來考慮，也沒有很大的必要去開發這樣的系統。另一方面，當發現有變異體時，我們要考慮HbA1c是否能準確評估血糖。如果不清楚，可以用其他指標，如糖化血清蛋白等指標來更經濟地解決這個問題。因此就沒有必要過多討論出現變異體時，糖化結果的準確性。所以，對於當地的變異體種類的了解以及各種方法學的抗幹擾能力的知曉是至關重要的。要達此目的，檢驗和臨床就應首選以分離為基礎的方法系統，尤其是國際上比較認可的品牌系統，來檢測糖化血紅蛋白。