科研和臨床檢驗場所PCR分子實驗使用頻率較高,PCR實驗怕出問題了,當PCR出現假陽性的時候,我們常常會考慮是不是引物、試劑、Mix、模板、水等發生了汙染,然後逐一排查,有時還是找不到原因,耗時耗力。
那麼這些試劑和儀器到底為什麼會被汙染了呢? 其實有很大因素是核酸氣溶膠汙染。
1、核酸檢測實驗需注意核酸氣溶膠汙染
核酸檢驗人都知道在核酸檢測實驗室內樣本的製備、擴增過程中都會產生各種汙染,比如樣本交叉汙染、試劑儀器交叉汙染、克隆質粒汙染、PCR擴增產物汙染、還有極容易忽視的氣溶膠汙染,氣溶膠是由固體或液體小質點分散並懸浮在氣體介質中形成的膠體分散體系,在空氣與液體面摩擦時,比如在核酸提取製備模板時,反覆吹吸/混勻震蕩反應液,以及PCR體系配液時充分震蕩反應管,開蓋時、吸樣時及汙染進樣槍的反覆吸樣都可形成氣溶膠而汙染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由其造成的汙染是一個非常重要而被忽視的汙染源。
DNA/RNA氣溶膠汙染的問題,很嚴重,廣泛分布在樣本容器、實驗室臺面,試劑溶液中、儀器表面、內管附著等等,極其微量的氣溶膠汙染即可造成假陽性的結果,進而可能引起整個PCR實驗室的汙染,嚴重的甚至要關閉實驗室,嚴重影響實驗工作,甚至耽誤疫情防控工作的開展。
2、實驗室為何會出現氣溶膠?
在核酸檢測實驗過程中,高速運轉離心時未蓋緊試管蓋;
手工提取核酸時劇烈地搖動反應管;
短時間處理大量的樣本核酸提取實驗;
PCR擴增完成後開蓋;
吸樣時及移液器的反覆吸樣;
處理血液樣本時,標本暴漏在實驗室空氣中。
以上舉例部分的這些行為都會使空氣與液體表面摩擦,產生核酸氣溶膠, 這些核酸小液滴還會落到實驗臺面、PCR儀、移液槍、吸頭、盒子、檢測人員衣服、頭髮、門把手等等地方,如果我們不注意,這些核酸氣溶膠就會日積月累地積聚,這樣做檢測實驗就特別出現問題比如PCR假陽性或者像報導中的造成檢測人員的感染。大面積核酸氣溶膠汙染非常難以清除,若不採取清理與預防措施,汙染會更加嚴重,長期釋放汙染核酸,終會不僅導致實驗室停工也會導致檢測人員的健康問題,所以對於核酸氣溶膠汙染一定要給予重視。
3、如何避免產生氣溶膠汙染呢?
第一:自我防護是關鍵,相對於一線的醫生,檢測人員的防護服、口罩、防護鏡等一個也不能少;《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》中就指出病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸提取、生化分析,以及臨床樣本的滅活等操作,應當在生物安全二級實驗室進行,同時採用生物安全三級實驗室的個人防護。
第二:每次檢測實驗前後,都要使用專業的核酸氣溶膠汙染清潔劑,對檢測臺面、核酸提取儀、PCR儀、手持移液器、離心機、振蕩器、空氣、門把手、地面、牆壁等位置進行徹底清楚殘核酸留氣溶膠和潛在汙染源,保證檢測樣本的準確性和檢測人員的安全性。
第三:加強氣溶膠汙染的監測工作。通過專業監測試劑盒對醫療場所和檢測場所都進行定期監控,做好防護,一旦發現醫療場所檢測出陽性樣本,應及時暫定場所的使用,對過消毒、氣溶膠清除等措施,儘可能防止病毒通過場所間接擴散;據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由其造成的汙染是一個非常重要而被忽視的汙染源。氣溶膠汙染廣泛分布在樣本容器、實驗室臺面,試劑溶液中、儀器表面、內管附著等等,極其微量的氣溶膠汙染即可造成檢測樣本假陽性的結果,進而可能引起整個PCR實驗室的汙染,嚴重的甚至要關閉實驗室,嚴重影響疫情的診斷和防治工作,所以說汙染監測刻不容緩。
除採取上述措施之外,新冠核酸檢測實驗室還應該使用無菌濾芯吸頭、無菌離心管等耗材,儘量減少實驗環節的意外因素,減少核酸檢測實驗產生的氣溶膠、液體飛濺等造成的實驗儀器、移液器等汙染,而影響結果的判讀。如有因操作失誤或意外引起的實驗室生物安全,還需參考《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》中相關措施進行處理:
(一)新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性材料汙染生物安全櫃的操作臺造成局限汙染:使用有效氯含量為0.55%消毒液,消毒液需要現用現配,24小時內使用。此後內容中有效氯含量參照此濃度。
(二)含病毒培養器皿碎裂或傾覆造成實驗室汙染:保持實驗室空間密閉,避免汙染物擴散,使用0.55%有效氯消毒液的毛巾覆蓋汙染區。必要時(大量溢撒時)可用過氧乙酸加熱燻蒸實驗室,劑量為2g/m3,燻蒸過夜;或20g/L過氧乙酸消毒液用氣溶膠噴霧器噴霧,用量8ml/m3,作用1~2小時;必要時或用高錳酸鉀-甲醛燻蒸:高錳酸鉀8g/m3,放入耐熱耐腐蝕容器(陶罐或玻璃容器),後加入甲醛(40%)10ml/m3,燻蒸4小時以上。燻蒸時室內溼度60%-80%。
(三)清理汙染物嚴格遵循活病毒生物安全操作要求,採用壓力蒸汽滅菌處理,並進行實驗室換氣等,防止次生危害。(轉自先達基因-gendx.cn)