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細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數的常用方法,也是判定細胞活力的重要指標,是培養細胞生物學特性的基本參數之一。
一般細胞傳代之後,經過短暫的懸浮然後貼壁,隨後度過長短不同的潛伏期,即進入大量分裂的指數生長期。在細胞達到飽和密度後,停止生長,進入平頂期,然後退化衰亡。為了準確描述整個過程中細胞數目的動態變化,典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期,斜率較大的指數生長期,呈平臺狀的平頂期及退化衰亡4個部分。以存活細胞數 (萬/mL)對培養時間(h或d)作圖,即得生長曲線。
一般而言,主要研究的是對數生長期的生長曲線。
測定生長曲線的方法
1.細胞計數法(簡單、最常用、有誤差)
1)傳代後把細胞重懸,得到細胞懸液,把懸液均勻加到24孔板中。
2)24h後開始進行細胞計數,以後每隔24h計數一次,每次取4孔細胞,分別進行計數,計數結果取4孔的平均值,連續計數六天。
3)根據細胞計數結果,以單位細胞數(細胞數/mL)為縱坐標,以時間為橫坐標繪製生長曲線。
24孔板
細胞計數板
細胞計數
1.MTT法(複雜、誤差小)
MTT:全稱為3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide
漢語化學名:3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽
商品名:噻唑藍,是一種黃顏色的染料。
活細胞的線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠使外源性的MTT還原,同時在細胞色素C的作用下,生成不溶於水的藍色(或藍紫色)絡合物甲臢。
按照時間間隔,通過酶聯免疫檢測儀在490nm(或570nm)波長處測定甲臢的光吸收值(A值)。
在通常情況下,甲臢生成量與活細胞數成正比,因此可根據光吸收值推算出活細胞的數目。由於死細胞中不含琥珀酸脫氫酶,因此加入MTT不會有反應。
1)標準曲線測定
例如用培養液將待檢細胞重懸,得到細胞懸液,按照4x104/ml細胞密度梯度,分別接種於96孔板,每孔100µL,重複3孔。採用MTT法測量吸光值A值,同一濃度下測得的A值為該濃度下3孔的平均值。依檢測結果,得到吸光值A值與細胞濃度的對應關係,繪出標準曲線。
2)細胞生長曲線的測定:
例如用培養液將待檢細胞製成1x104/ml的細胞懸液,分別接種於多塊96孔板,每孔100µL,在24、48、72、96及120h時間點取一塊96孔板,採用MTT法測量吸光值A值得到吸光值A值與時間的關係。
根據標準曲線計算出相應的細胞數,再繪製出細胞的生長曲線。
細胞生長曲線擬合
1.曲線擬合
曲線擬合(curve fitting)是指選擇適當的曲線類型來擬合觀測數據,並用擬合的曲線方程分析兩變量間的關係。
2.SPSS
SPSS是世界上最早的統計分析軟體,由美國史丹福大學的三位研究生Norman H.Nie、C.Hadlai(Tex)Hull和Dale H.Bent於1968年研發成功,同時成立了SPSS公司,並於1975年成立法人組織、在芝加哥組建了SPSS總部。
1984年SPSS總部首先推出了世界上統計分析軟體微機版本SPSS/PC+,開創了SPSS微機系列產品的開發方向,極大的擴充它的應用範圍,並使其能夠很快的應用於自然科學、技術科學、社會科學的各個領域。
通常的,細胞生長曲線的函數擬合模型是
Y=a ebt
但由於細胞增殖是二次分裂生長,所以選用
Y=a 2bt
作為細胞生長曲線的擬合模型更為合適,又因為在SPSS中的曲線擬合功能選項中並沒有的Y=a 2bt函數擬合模型,只有Y=a ebt,於是我們可以通過變換:
從而能使用SPSS中的函數擬合模型進行曲線擬合。
1.原始數據
曲線1:培養天數x ln2
K=t ln 2 Y=a ebk
曲線2:進入對數生長期天數x ln2
m=(t -2)ln 2 Y=a ebm
依據以上變量進行曲線擬合,記錄相應的a,b值。
細胞群體倍增時間的簡化計算方法
細胞群體倍增時間的計算方法有兩種。
1.做圖法:在細胞生長曲線的對數生長期找出細胞增加一倍所需要的時間,即倍增時間。
2.公式法:按細胞倍增時間計算細胞群體倍增時間,其為公式為:
Td=∆t Lg2/(LgNt-LgN0)
(Nt為對數生長期任一點的理論觀察值,N0為對數生長期理論初始值。)
計算比較複雜,而我們基於以往曲線進行理論推導而行的理論倍增時間,計算相對簡單。
推導過程:
結果:
曲線1:
b=0.855
Td=24h/b=28.070h
曲線2:
b=0.921
Td=24h/b=26.059h
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