(一)概述
在營養物質一定的體外培養體系中,無菌培養條件下,動物細胞的生長狀況和生長速度與接入的細胞密度有關係。描述細胞生長的連續變化中細胞密度與培養時間的關係,往往用細胞生長曲線表示,包括遲緩期、對數生長期、穩定期和衰退期(圖
9-7)。正確的生長曲線描述,依賴正常的培養條件和無菌操作,並且需要熟練的細胞計數操作。細胞生長曲線是以細胞密度為縱坐標、累計培養時間為橫坐標作圖描繪的折線圖,也可以直接以細胞密度作縱坐標、累計培養時間為橫坐標在半對數表上作圖描繪的折線圖。若每隔24h測定細胞密度,可用天(d)作累計培養時間單位,若隔12h或更短時間測定細胞密度,建議使用小時(h)作累計培養時間單位。
作為細胞生長曲線觀察用的培養物,在後續培養過程中,不得改變培養體系即培養液的體積,要確保培養條件的穩定。需要換液時採用定量換液方法操作,使用同樣體積的新鮮培養液替代廢棄培養液,不幹擾細胞團,不取出細胞。培養條件包括溫度、
CO2濃度、趨飽和溼度,一般要求37℃、5%CO2濃度、相對溼度90%以上的條件下進行哺乳動物細胞培養。
(二)生長曲線對於哺乳動物細胞培養的意義
典型的生長曲線包括遲緩期、對數生長期、穩定期和衰退期這4個時期。生長曲線也是細胞株具有的特有屬性,不同細胞株的生長曲線圖形不完全一致。
日常培養的細胞株用於某種目的前,最好預先培養以便觀察其細胞生長曲線,了解該細胞株的合理接種密度。
(1)當接種細胞密度足夠高時,將不出現典型的遲緩期或遲緩期很短,並且到達衰退期的累計培養時間最短。進行細胞藥理或細胞毒理試驗時,預培養的細胞接種密度往往控制在1×105-2×105/ml範圍,以便在加載供試藥物時,所培養的細胞處於對數生長期並已形成單層或接近單層。
(2)當接種細胞密度合理時,會出現典型的遲緩期,並且到達衰退期的累計培養時間比較短。正因為如此,進行傳代培養、原代培養、擴大培養時,一般細胞培養時都要控制接種密度在2×104-5×105/ml範圍。
(3)當接種細胞密度太低時,會出現很長的遲緩期,很難觀察到對數生長期、穩定期和衰退期,要觀察到衰退期的累計培養時間非常長。在依賴哺乳動物細胞培養進行生物製品生產的過程中,尤其需要避免此種細胞密度下的接種培養,以免造成不必要的經濟損失和時間浪費。