責編 | 兮
通過將轉錄激活因子與CRSIPR-Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins）系統的效應蛋白融合，研究人員已經開發了一系列轉錄激活工具【1-5】。利用這些轉錄激活工具可以在不改變基因組DNA的情況下，直接激活細胞內源基因的表達，有望治療一些由於內源基因表達不足導致的遺傳疾病，並避免基因編輯導致的DNA脫靶等副作用。例如，激活HBG基因的表達可以治療HBB基因突變導致的β-地中海貧血。但是，現有轉錄激活工具激活內源基因表達的效率仍然不高，如何提高轉錄激活的效率成為亟待解決的科學問題。
近日，中山大學生命科學學院的松陽洲教授課題組在Nature Communications發表題為Repurposing Type I-F CRISPR-Cas System as a Transcriptional Activation Tool in Human Cells的文章，首次把type I-F CRSIPR-Cas系統Cascade複合物的Csy3亞基與VPR（VP64-p65-Rta）融合, 證明type I-F CRISPR-Cas系統可以高效激活哺乳動物細胞內源基因的表達。
與只含有一個效應蛋白的Class 2 CRISPR-Cas系統不同（如Cas9, Cas12a等），Pseudomonas aeruginosa type I-F CRISPR-Cas系統的Cascade複合物（PaeCascade）包含了4個效應蛋白，其中，Csy3亞基有6個拷貝，將VPR與Csy3亞基融合可能可以提高基因的轉錄激活效率。為此，作者把 PaeCascade複合物中的4個亞基（Csy1, Csy2, Csy3和Csy4）分別與VPR融合表達，發現將Csy3與VPR融合表達時（PaeCascade-VPR），其激活外源GFP基因表達的效率最高（圖1）。
圖1
隨後，作者利用PaeCascade-VPR激活細胞內源基因（如HBB，HBG等），並與現有的CRISPR-Cas轉錄激活系統（dCas9-VPR, dAsCas12a-VPR, EcoCascade-VPR）進行了對比，發現在多個位點PaeCascade-VPR的轉錄激活效率都是最高的（圖2 b-e）。
圖2
為了進一步提高PaeCascade-VPR的轉錄激活效率，作者嘗試延長crRNA的間隔序列，從而增加 Cascade複合物中Csy3的拷貝數，發現PaeCascade-VPR的激活效率隨著crRNA間隔序列的延長有明顯提高（圖3）。
圖3
最後，作者比較了PaeCascade-VPR和dCas9-VPR系統的脫靶效應, 發現在多個潛在的脫靶位點均未檢測到PaeCascade-VPR對脫靶基因的轉錄激活，說明PaeCascade-VPR的特異性高（圖4）。
圖4
總體而言，該工作開發了以type I-F CRISPR-Cas系統為基礎的哺乳動物高效轉錄激活工具，為哺乳動物細胞的基因表達調節提供了新的工具。該系統通過將Cascade的Csy3亞基與VPR融合，提高了CRISPR-Cas轉錄激活系統激活內源基因表達的效率，且其激活效率還可以通過延長crRNA的間隔序列從而進一步提升。該研究彌補了現有CRISPR-Cas轉錄激活系統對某些基因位點激活效率低的不足，有望用於治療內源基因表達不足導致的遺傳疾病。
據悉，松陽洲教授課題組博士後陳昱僖和2018級博士生劉嘉琪為共同第一作者，松陽洲教授和梁普平副教授為共同通訊作者。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41467-020-16880-8
1.Gilbert, L.A., et al., CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell, 2013. 154(2): p. 442-451.
2.Tanenbaum, M.E., et al., A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell, 2014. 159(3): p. 635-46.
3.Konermann, S., et al., Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015. 517(7536): p. 583-8.
4.Breinig, M., et al., Multiplexed orthogonal genome editing and transcriptional activation by Cas12a. Nat Methods, 2019. 16(1): p. 51-54.
5.Pickar-Oliver, A., et al., Targeted transcriptional modulation with type I CRISPR-Cas systems in human cells. Nat Biotechnol, 2019. 37(12): p. 1493-1501.