Nat Met|小型Cascade–Cas3系統精準敲除

撰文 | 木蘭之枻

責編 | 兮

CRISPR-Cas系統是原核生物的「獲得性免疫系統」，藉此可以抵抗噬菌體為代表的「入侵者」。總體而言，CRISPR-Cas系統可分為兩大類，I型系統需要多個Cas蛋白形成功能性複合物發揮作用；II型系統通常只依賴於單一的Cas蛋白。考慮到系統的便捷性，II型系統更受研究者關注，也是目前基因編輯的主力工具。不過，I型系統亦有其獨特之處：其在原核生物中廣泛存在，因此或可直接調用內源性的I型系統用於原始宿主的基因編輯；此外，其解旋-核酸酶Cas3經crRNA定位後，可沿基因組移動並持續降解鄰近的DNA，而II型Cas蛋白則缺乏這種能力，這意味著I型系統在基因組大片段敲除方面更具潛力。近來多篇文章在人源細胞中證實，I型系統可被改造用於基因編輯（詳見BioArt報導：Molecular Cell | 張燕/可愛龍合作組利用I型CRISPR-Cas系統實現大片段基因敲除 ）【1-3】和轉錄調控（詳見BioArt報導：Nat Comm | 松陽洲組成功開發基於type I-F CRISPR-Cas系統的高效轉錄激活工具 ）【4-6】，證實了其用於基因編輯的可行性。不過目前I型CRISPR-Cas系統在原核生物中的應用依然有限，且缺乏系統性的評估和優化。

2020年10月19日，來自加州大學舊金山分校（UCSF）微生物與免疫學系的Joseph Bondy-Denomy實驗室在Nature Methods發表題為A compact Cascade–Cas3 system for targeted genome engineering的論文。文章對綠膿桿菌(p.aeruginosa)來源的I-C型CRISPR系統PaeCas3c進行改造，並在多種原核生物中對改造後的PaeCas3c的基因編輯能力進行驗證。研究發現，PaeCas3c系統可快速高效的實現基因組的大片段精準敲除和基因組最小化研究，為基因組級別的敲除研究提供了有力的工具。

PaeCas3c屬於小型的I型CRISPR系統，只需四種Cas蛋白便可形成功能性複合物，而其它I型系統如I-E型系統則需要六種蛋白。為探究PaeCas3c的功能，研究者利用早先構建的攜誘導型PaeCas3c系統的綠膿桿菌PAO1菌株開展研究。非誘導條件下，crRNA表達對綠膿桿菌本身並無明顯的毒性作用。隨後在誘導條件下，研究者導入特異性crRNA，靶向綠膿菌素（綠膿桿菌呈現綠色的關鍵）生成的關鍵基因phzM，發現很高比例的綠膿桿菌克隆呈黃色。測序顯示，這類黃色綠膿桿菌phzM基因周圍有20-60kb的大片段缺失，且靶位點位於缺失的大片段內部。這一結果表明，PaeCas3c系統能在靶位點附近雙向誘導基因組大片段缺失。

隨後的研究發現，原始版本的crRNA表達載體中的直接重複序列易發生重組，這對PaeCas3c系統介導的基因編輯有嚴重幹擾。而後研究者對此進行突變改造，改造後的crRNA表達載體效果提升明顯，其介導的基因編輯效率可達94-100%。

之後，研究者在綠膿桿菌中對PaeCas3c系統與Cas9系統介導的基因編輯效果進行了對比，結果發現Cas9系統多介導基因組小片段缺失，且編輯效率偏低；而PaeCas3c則可高效介導基因組大片段缺失，缺失片段的平均長度可達26.6-48.2kb。考慮到Cas3持續降解單鏈DNA的能力，研究者還對其促進同源重組修復的效果進行了檢測。結果顯示，無論是249kb大片段敲除後的同源重組修復，亦或是0.17kb小片段敲除後的同源重組修復，PaeCas3c都有較高的效率，且明顯優於Cas9系統。之後，研究者還在綠膿桿菌中證實，PaeCas3c系統在基因組最小化研究中也有明顯的優勢。

研究者還設計出可同時表達PaeCas3c系統所有功能元件的單一載體，並在大腸桿菌、丁香假單胞菌番茄致病變種以及克氏肺炎桿菌中驗證了其基因組大片段敲除的效果。研究結果顯示，PaeCas3c系統在以上三種原核生物中均能實現高效的基因組大片段敲除。

研究者還證實，在最早發現PaeCas3c系統的原始菌株PaLML1中，特異性crRNA的導入同樣可誘導基因組靶位點的大片段缺失以及同源重組修復介導的精準編輯。研究還發現，內源性的I-F型CRISPR-Cas系統也可被改造用於原始菌株基因組靶位點的大片段敲除及精準編輯。此外，研究還指出，由於抗CRISPR蛋白（acr）的存在，內源性I型CRISPR-Cas系統的編輯效率會受到幹擾，而這可以通過表達抗CRISPR蛋白的負向調控因子（抗抗CRISPR蛋白）加以改善。

總體而言，本研究通過改造優化小型Cascade-Cas3系統PaeCas3c，在細菌中實現了快速高效的基因組大片段敲除及精準編輯，並在細菌基因組最小化研究中有明顯優勢。此外， Cascade-Cas3系統能明顯促進大片段敲除後的同源重組修復過程，這意味著該系統在基因組大片段的精準編輯及功能研究中極具潛力，並值得更進一步的探索。

原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41592-020-00980-w

製版人：十一

參考文獻

1. Dolan, A. E. et al. Introducing a spectrum of long-range genomic deletions in human embryonic stem cells using type I CRISPR-Cas. Mol. Cell 74, 936–950.e5 (2019).

2. Morisaka, H. et al. CRISPR–Cas3 induces broad and unidirectional genome editing in human cells. Nat. Commun. 10, 5302 (2019).

3. Cameron, P. et al. Harnessing type I CRISPR–Cas systems for genome engineering in human cells. Nat. Biotechnol. 37, 1471–1477 (2019).