Plant Biotechnol J|中國臺灣中央研究院|基於植物原生質體的基因編輯技術

2021-02-13 萊肯生物

植物原生質體不僅是細胞融合的理想材料，也是遺傳修飾的優選受體。近日，中國臺灣中央研究院的科研人員應用原生質體技術進行基因編輯，實現了單細胞基因突變修飾及植株再生。文章首先改良了禾本科、十字花科和茄科等近10種植物的原生質體分離和轉染的技術流程，並發展了菸草原生質體的分離方法，同時實現了突變後的單個菸草原生質體再生為成熟植株。同時文章結果顯示，在編碼Cas9和sgRNAs的載體瞬時轉化原生質體以後，通過PCR擴增單個原生質體靶標基因，進而分析突變效率，是快速評價基因編輯效率的有效策略。研究人員利用該方法突變了菸草八氫番茄紅素脫氫酶基因（NtPDS），再生白化植株的基因型分析結果顯示，在雙二倍體菸草中，4個NtPDS等位基因均發生了突變，且在大多數的再生植物中未檢測到Cas9的DNA。此外，研究人員利用該方法也成功實現了玉米原生質體ZmIPK的基因編輯。

 

Plant Biotechnology Journal,  12 December 2017

Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9 mutagenesis: From single cell mutation detection to mutant plant regeneration

Authors

Choun-Sea Lin,Chen-Tran Hsu,Ling-Hung Yang,Lan-Ying Lee,Jin-Yuan Fu,Qiao-Wei Cheng,Fu-Hui Wu,Han Chen-Wei Hsiao,Yesheng Zhang,Ru Zhang,Wan-Jung Chang,Chen-Ting Yu,Wen Wang,Li-Jen Liao,Stanton B. Gelvin,Ming-Che Shih

Summary

Plant protoplasts are useful for assessing the efficiency of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR Associated Protein 9 (Cas9) mutagenesis. We improved the process of protoplast isolation and transfection of several plant species. We also developed a method to isolate and regenerate single mutagenized Nicotianna tabacum protoplasts into mature plants. Following transfection of protoplasts with constructs encoding Cas9 and sgRNAs, target gene DNA could be amplified for further analysis to determine mutagenesis efficiency. We investigated N. tabacum protoplasts and derived regenerated plants for targeted mutagenesis of the phytoene desaturase (NtPDS) gene. Genotyping of albino regenerants indicated that all four NtPDS alleles were mutated in amphidiploid tobacco, and no Cas9 DNA could be detected in most regenerated plants.

查看全文請戳下方「閱讀原文」！

相關焦點

  • Nature Plant l 搶救國寶牛樟! 牛樟全基因體定序重寫植物族譜
    內容來源於臺灣中央研究院官網牛樟（Cinnamomum kanehirae Hayata）不但是上等木材，可以提煉芳香精油，更能培養俗稱(森林紅寶石)的牛樟芝，被譽為國寶級喬木。然而，這樣的森林珍寶，卻因遭受大量盜採而瀕臨絕種。牛樟因其獨特的身世，在演化及分類學中有其重要價值，而找出牛樟特別的基因，對其復育更至關重要。
  • 利用大豆愈傷原生質體評估CRISPR/LbCpf1系統crRNA活性
    源於毛螺科菌ND2006的V型CRISPR蛋白LbCpf1（Cas12a）具有很多獨特的優勢，已成功應用於植物基因組的精確編輯。
  • Yakult丨植物原生質體分離原理及方法
    原生質體是指植物細胞去掉細胞壁的裸露部分。它在培養條件下，①具有再生細胞壁，進行連續的細胞分裂並再生成完整植株的能力；②具有攝取外源大分子、細胞器，以及細菌，病毒的能力，因此是進行遺傳操作，基因轉移的好材料；③通過同種和異種植物的原生質體融合，可產生異核體，實現體細胞雜交，培育出新品種。
  • 「原生質體」的疑惑解析
    【模擬題】甲、乙是染色體數目相同的兩種二倍體藥用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小組擬培育同時含有A和B的新型藥用植物。請回答：（1）為了培育該新型藥用植物，可取甲和乙的葉片，先用纖維素酶和果膠酶去除細胞壁，經離心純化。經過誘導融合得到雜種細胞。【分析】在獲取原生質體的過程中會混有雜質，所以需要離心純化。
  • 高精準胞嘧啶鹼基編輯工具！植物基因工程技術又進一步
    鹼基編輯技術（Base Editing）是基於CRISPR系統開發的基因組定向修飾技術。基因組編輯工具單鹼基編輯器的開發，為定向編輯和修正基因組中的關鍵核苷酸變異提供了重要工具，展現了其在遺傳疾病治療與動植物新品種培育等方面潛在的重大應用價值。
  • 研究建立快速篩選丁布類代謝物合成和轉錄相關基因的玉米原生質體...
    作為玉米最重要的抗蟲化合物，丁布類次生代謝物的生物合成途徑已基本闡明，但是玉米功能基因研究相對緩慢，再加上玉米轉基因技術的眾多缺陷，特別是轉化效率低以及周期長的問題，使得丁布類次生代謝物的調控研究變得十分棘手，玉米抗蟲機理的研究進展比較緩慢。植物原生質體體系具有高效、便捷和經濟等優點，有利於各種植物信號途徑中功能基因的研究，已成為一種研究植物生理生化和分子機理的重要工具。
  • 陳其軍/高彩霞合作利用引導編輯技術對玉米基因組進行精準編輯
    引導編輯技術是一種全新的基於CRISPR/Cas系統的精確基因組編輯技術【1】，但目前在植物（水稻）中的編輯效率普遍較低【2-8】。與之前水稻中的研究結果相比，該研究在玉米上獲得了更高的編輯效率（最高約達72%~75%），同時，該研究首次利用引導編輯工具在兩個乙醯乳酸合酶基因ZmALS1和ZmALS2中實現了純合突變，且獲得了這兩個基因的W542L和S621I雙位點突變體
  • Cpf1-crRNA成為DNA-free基因編輯的稱手工具
    由於在目標位置的選擇、外源DNA的引入、操作的便利性等方面具有優勢，CRISPR/Cpf1系統常被人們成為「第二代基因編輯神器」。但是，由於密碼子偏愛性等因素的影響，CRISPR/Cpf1在植物中實際的應用效果並不理想。最近，基於Cpf1核糖核酸酶的特點，科學家通過體外構建Cpf1–crRNA核糖核蛋白複合體的方式實現了對大豆和菸草的基因組編輯，DNA-free的方式不僅提高了編輯效率，還避免了因載體插入而引起的各種問題。
  • 臺灣中央研究院餘淑美團隊揭示水稻糖含量調控機制
    保持體內的糖含量平衡對於植物的正常生長代謝和脅迫耐受具有重要作用，缺糖或有糖能夠啟動或關閉某些基因的表達，這是糖含量調控的主要機制
  • 精準基因編輯技術的研究進展
    自2012年，CRISPR/Cas9基因組編輯系統被首次發現之後，國內外的研究者對於其優化升級和應用一直沒有停息過——為了獲得一種更精準、更便捷和更經濟的基因組編輯工具而不斷探索和實踐。我們都知道，CRISPR/Cas9基因編輯技術的工作原理是Cas9蛋白切割目標基因形成雙鏈缺口，然後進行目的修復，從而達到修改基因片段的目的。但是這種修復帶有不確定性，引入隨機的插入和缺失。
  • 原生質體的應用、分離、純化、培養
    原生質體分離時主要應考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時間、溫度等。 　　(1)外植體來源：生長旺盛、生命力強的組織和細胞是獲得高活力原生質體的關鍵，並影響著原生質體的複壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。用於原生質體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、愈傷組織、懸浮培養物(Suspension cultures)、原球莖、花瓣和葉表皮等。
  • 遺傳所開發出高精準胞嘧啶鹼基編輯工具
    鹼基編輯技術是基於CRISPR系統開發的基因組定向修飾技術。該技術由於不需要DNA雙鏈斷裂和外源供體DNA可以實現對目的鹼基的精準替換，在疾病治療、植物性狀改良等方面具有很大的應用潛力。不過，其脫靶效應仍是目前存在的一大難題。
  • 高彩霞課題組開發出高精準胞嘧啶鹼基編輯工具
    鹼基編輯技術是基於CRISPR系統開發的基因組定向修飾技術。該技術由於不需要DNA雙鏈斷裂和外源供體DNA可以實現對目的鹼基的精準替換，在疾病治療、植物性狀改良等方面具有很大的應用潛力。不過，其脫靶效應仍是目前存在的一大難題。
  • 提綱挈領:苔蘚植物三巨頭中的角苔植物臺灣角苔基因組(Nature Plants)
    角苔類植物的植株結構具有較為簡單的形態學特徵，與其較低的遺傳冗餘相關，但是在該陸地植物早期分化形成的支系中已經建立起了用於植物發育調控的基礎性轉錄調控網絡。儘管臺灣角苔的基因組比較小，並且遺傳冗餘也較少，但是作者仍是鑑定到了與RNA編輯、UV保護以及乾燥耐性相關基因家族的擴張。另外，作者在臺灣角苔中檢測到了來自細菌和真菌的水平轉移基因，尤其是參與脅迫響應和代謝通路相關的基因。
  • Nat Biotechnol:中科院高彩霞團隊成功開發植物基因組引導編輯技術
    因此，迫切需要在植物中可使用的新型基因組工程方法。在此之前，美國哈佛大學的David R. Liu和他的同事們開發出一種新的稱為引導編輯（prime editing）的基因組編輯方法。這種方法使用工程化的Cas9切口酶（H840A）-逆轉錄酶（RT）融合蛋白和引導編輯嚮導RNA（prime editing guide RNA, pegRNA），可在人細胞中進行所需的編輯。
  • Mol Plant 2019年技術突破和資源類文章匯總
    由此，該團隊開發了一系列基於Cas9-NG架構的各種水稻基因組定點編輯工具，並成功用於水稻單基因敲除、多基因敲除、單鹼基編輯以及靶基因轉錄激活調控。　　.2019.03.011　　電子科技大學張勇教授和美國馬裡蘭大學Yiping Qi的合作團隊同樣在SpCas9變體xCas9和Cas9-NG的基礎上，結合原生質體瞬時編輯通量分析及穩定轉化具體評價策略，構建了多元化植物SpCas9基因組編輯系統，以水稻為模式材料，對植物版xCas9、Cas9-NG（Cas9-NGv1）核酸酶基因組編輯特性進行了深入解讀，系統評價了SpCas9
  • 組培大講堂 | 植物組織培養的一般方法(4)——原生質體培養
    原生質體培養的基本方法包括：材料的選擇與處理、原生質體的分離、純化、培養、誘導愈傷組織和再生植株。(1)材料選擇。葉片是植物原生質體最方便和最普遍的來源，葉片中的葉肉組織是游離原生質體的一種經典材料。它來源方便，供應及時，當有明顯的葉綠體存在時也便於在細胞融合中識別。(2)材料預處理預。
  • 中科院博士自述:選擇碩博研究方向的原因讓人大跌眼鏡 | 原生質體專題
    背景：2015年9月-2020年7月，中國科學院遺傳與發育生物學研究所進修博士專業：遺傳學聽說張博不僅在實驗裡原生質體轉化、載體構建、植物組培、蛋白表達等各種實驗室常規分子、生化和細胞學實驗技術樣樣在行，在生活中還是枚可愛的吃貨。
  • 植物CRISPR 基因組編輯技術的新進展
    因此，讀懂「基因組序列的―含義」並將之用於農作物改良成為「後功能基因組學」時代植物學研究的主要仸務。植物基因功能的解析和農作物的遺傳改造需要進行各種遺傳操作 (Genetic modification)。在過去的 20 年中，物理化學誘變、T-DNA 插入突變和基於 RNAi、artificial microRNA 的靶向基因抑制技術被廣泛地用於擬南芥、水稻等模式生物的基因功能解析。
  • 北京市農林科學院玉米基因組編輯團隊在基因編輯技術方面再獲新進展
    該研究建立了基於SpCas9變體xCas9的基因敲除系統和胞嘧啶鹼基編輯系統，成功將基因編輯的前間區序列鄰近基序（PAM）範圍拓展至GAD（D=A,T,G）和鬆弛型的NG，為在更廣泛的基因組範圍內選擇基因編輯靶點提供了可能。　　拓展CRISPR/Cas9核酸酶PAM範圍是使其在植物中被更廣泛應用的關鍵。