Cell Stem Cell丨肺部疾病研究新工具:iPSC誘導的氣管基底幹細胞

　　撰文 | 鹹姐

　　人類肺部小氣道在如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、閉塞性細支氣管炎和囊性纖維化等多種肺部疾病中均會發生病變，稱為病理性氣道重塑，可影響上皮細胞、基間質以及這些組織之間的相互營養作用。正常人的氣道大部分是由纖毛細胞、分泌細胞和6-30%的基底細胞組成的假復層上皮，這些細胞的比例沿近-遠端軸變化。其中基底細胞（basal cell，BC），因其接近基底層而得名。BC豐富的細胞骨架蛋白、連接蛋白和粘附蛋白有助於將上皮細胞錨定在基質上，並將底層基質與外界隔絕。目前的實驗已證實，氣道BC是相對未分化的多能幹細胞群，可以作為重要的特殊上皮細胞類型（如分泌細胞SC和多壁細胞MCC）的前體再生氣道上皮細胞，從而促進正常上皮細胞的穩態和損傷後上皮細胞的有序再生，並且可能參與了一些呼吸系統疾病的易感性、啟動和發展【1,2】。

　　BC表達多種標誌物，包括腫瘤蛋白63（TP63）、細胞骨架蛋白角蛋白5（KRT5）和神經生長因子受體（NGFR）。儘管成人肺部的氣道BC已被廣泛研究，但對其發育起源的研究直到最近才興起。小鼠的譜系追蹤實驗顯示，在最初肺芽形成（胚胎期9.5 [E9.5]）的肺上皮祖細胞亞群中，Tp63程序已經存在於肺發育的早期階段，表達標記所有發育中肺上皮細胞的轉錄調節因子——NK2同源框1（Nkx2-1）。由於缺乏BC形態和分子程序，早期的Nkx2-1+/Tp63+共表達細胞並不屬於BC，相反，這些胚胎細胞可以作為隨後肺泡和氣道上皮的多潛能祖細胞發揮作用。最初，Tp63在未成熟的氣道祖細胞中廣泛表達，後來則逐漸局限於定位在基底膜且上調成人BC標記物（Krt5和Ngfr）的氣管細胞亞群中【3】。

　　目前，控制肺內BC規範和成熟的信號通路尚不清楚，不過，根據氣道BC的幹細胞特性，包括其增殖潛能，研究人員已經開發出成熟的方案在體外擴大培養人原代BC。這些BC通常被稱為人支氣管上皮細胞（HBEC），可在氣液界面（ALI）培養中分化為假復層氣道上皮細胞，再現了體內氣道生物學的各個方面。通過這一模型，對獲得性和遺傳性的人類氣道疾病，包括哮喘的粘液化生、囊性纖維化（CF）的氯離子轉運缺陷以及原發性纖毛運動障礙(PCD)的纖毛功能障礙等的認識有了新的進展【4,5】。而隨著人類誘導多能幹細胞（iPSC）的發展，人們意識到從iPSC中獲得組織特異性幹細胞將對再生醫學具有廣泛而深遠的意義。近年來已有研究成功從iPSC定向分化為氣道上皮細胞類型，包括表達經典BC標記的TP63的細胞，然而產生具有與成人BC相似的幹細胞特性的詳細特徵的真正的BC尚未被報導。

　　2020年10月23日，來自美國波士頓大學和波士頓醫學中心的Darrell N. Kotton團隊在Cell Stem Cell在線發表題為「Derivation of Airway Basal Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells」的文章，首次報導了一種可以從人iPSC獲取氣道基底細胞（iBC）的定向分化方案，由此得到的iBC含有原代基底細胞的幹細胞特性，包括自我更新和多系分化潛能，從而為體外氣道疾病建模和體內氣管異種移植物的再增殖提供了巨大的機會。

　　

　　已知NKX2-1是所有發育中的肺上皮細胞內最早表達的轉錄調節因子，而TP63是BC程序表達所需的經典轉錄因子，因此本文的研究人員首先建立了一種工具，能夠可視化並純化來自體外iPSC的NKX2-1+/TP63+的肺基底細胞，同時排除任何非基底細胞（NKX2-1-/TP63+），即GFP和tdTomato雙螢光報告iPCS細胞系BU3 NKX2-1GFP;P63tdTomato（BU3 NGPT）。利用該iPSC細胞系誘導肺祖細胞近端氣道定向分化的過程中（圖1），研究人員發現，TP63 tdTomato（簡稱TOM+）最早表達於分化第15天左右的NKX2-1GFP+（簡稱GFP+）細胞中，並且發現分離出來的NKX2-1GFP+/ TP63 TOM+單細胞可以在氣道無血清培養基（FGF2+10+DCI+Y）的3D培養條件下增殖。

　　

　　圖1 氣道定向分化示意圖

　　隨後，研究人員從自我更新能力、多系分化潛能和典型BC標記物NGFR的表達等方面對氣道分化產生的NKX2-1GFP+/TP63 TOM+細胞進行表徵，結果顯示GFP+/TOM+細胞的NGFR低表達，且多系分化不一致，提示其尚不是成熟的BC。但是將分化第30-32天的GFP+/TOM+細胞分離出來，放入適合原代人類BC培養的BC培養基（含有SMAD和ROCK信號小分子抑制劑）繼續3D培養後，GFP+/TOM+細胞球體表現出管腔不明顯，且細胞內的NGFR可以被快速地誘導。隨後，單細胞測序（scRNA-seq）結果顯示， NGFR只在BC培養基培養的基底樣細胞群中表達，並且此細胞群表現出最強的BC轉錄組特徵，表達典型的BC標誌物，由此表明BC培養基誘導的NGFR表達增加與成熟BC程序的增強一致。BC培養基培養下的GFP+/TOM+細胞與成人基底細胞有著最大的轉錄相似性，被稱為iBC。

　　進一步的實驗證實iBC具有與氣道幹細胞相同的關鍵特性——長期自我更新和多潛能分化。在BC培養基中，研究人員可以很容易地在iBC培養物的最外層細胞層中識別出NKX2-1GFP+/TP63TOM+細胞，而在ALI分化培養基中，BC、MCC和SC均可被鑑定出。為了更全面地評估iBC產生的分化細胞類型的分子表型，研究人員對2D ALI培養基培養的根據NGFR進行分選的細胞進行了scRNA-seq分析，鑑定出5類具有類似氣道上皮細胞類型的基因表達譜的細胞群以及一類增殖細胞群，同時檢測到與HBEC來源的BC、SC和MCC一致的基因表達模式的細胞。與體外分化培養一致的是，在小鼠體內氣管移植模型中，iBC也可以形成與真實的體內氣道相似的氣道上皮細胞結構和組成。

　　至此，研究人員成功獲得了iBC的定向分化方案，然而要擴大其應用價值，首先要實現的是在不需要向細胞中引入螢光報告基團的基礎上將各種正常或患者特異性iPCS細胞系分化為iBC。通過實驗，研究人員利用基於抗體的NGFR+細胞分選代替了GFP+/TOM+分選，從而成功從五類不同的iPSC/ESC細胞系分化出由BC、SC和MCC組成的假復層上皮細胞。與此同時，研究人員證實iPSC來源的氣道上皮細胞與人類氣道上皮細胞具有共同的關鍵生理和生物學特性，不使用螢光蛋白報告系統純化的患者特異性iBC同樣可以模擬三種具有不同上皮特徵的氣道疾病的特徵，包括哮喘中的粘液細胞上皮化生、CF中的離子通量異常和PCD中的纖毛運動缺陷。

　　綜上所述，本文報導了從iPSC定向分化為組織特異性幹細胞——氣道iBC的方法，這些分化的細胞在分子和功能上均與人類氣道的重要幹細胞——基底細胞非常相似，並且展現了這些iBC在模擬人類氣道發育和疾病方面的潛力，在異種氣管移植模型中證明了其體內再生氣道上皮細胞的能力。本文呈現的對組織特異性幹細胞氣道BC的誘導分化、純化、擴大和冷凍能力，克服了目前iPSC技術在呼吸道黏膜和肺上皮疾病研究中面臨的許多關鍵障礙，必將大大加速對人類肺部疾病的研究。

　　原文連結：https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.09.017

　　製版人：嘉

　　參考文獻

　　1. Rock, J.R., Randell, S.H., and Hogan, B.L.M. (2010). Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling. Dis. Model. Mech. 3, 545–556.

　　2. Rock, J.R., Onaitis, M.W., Rawlins, E.L., Lu, Y., Clark, C.P., Xue, Y., Randell, S.H., and Hogan, B.L.M. (2009). Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 106, 12771–12775.

　　3. Yang, Y., Riccio, P., Schotsaert, M., Mori, M., L€u, J., Lee, D.-K., Garca-Sastre, A., Xu, J., and Cardoso, W.V. (2018). Spatial-temporal lineage restrictions of embryonic p63+ progenitors establish distinct stem cell pools in adult airways. Dev. Cell 44, 752–761.e4.

　　4. Clancy, J.P., Cotton, C.U., Donaldson, S.H., Solomon, G.M., VanDevanter, D.R., Boyle, M.P., Gentzsch, M., Nick, J.A., Illek, B., Wallenburg, J.C., et al. (2019). CFTR modulator theratyping: current status, gaps and future directions. J. Cyst. Fibros. 18, 22–34.

　　5. Horani, A., Ferkol, T.W., Dutcher, S.K., and Brody, S.L. (2016). Genetics and biology of prima

特別聲明：以上內容(如有圖片或視頻亦包括在內)為自媒體平臺「網易號」用戶上傳並發布，本平臺僅提供信息存儲服務。

Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services.