大家好，本周為大家帶來一篇發表在Journalof the American Society for Mass Spectrometry上的文章，Quantificationof the Effect of Citrulline and Homocitrulline Residues on theCollision-Induced Fragmentation of Peptides，文章通訊作者是ELTEEötvös Loránd University的GittaSchlosser。
蛋白質的翻譯後修飾，如瓜氨酸化（citrullines）和氨基甲醯化(carbamylation)與某些疾病有關。由於複雜生物樣品中分析物的濃度低，且瓜氨酸化和氨基甲醯化殘基結構高度相似，因此很難對瓜氨酸化和氨基甲醯化的蛋白質或肽進行詳細的分析表徵。作者團隊創建了嚴格的胰蛋白酶樣模型系統，以定量瓜氨酸的作用並研究是否高瓜氨酸(homocitrulline)殘基也有作用。結果表明，瓜氨酸殘基在其C端顯著增加了片段化。相比之下，高瓜氨酸殘基在相同能量下顯示出不確定的結果。同時，效應的強度取決於碰撞能量以及序列中瓜氨酸和高瓜氨酸的位置。
瓜氨酸化是酶對精氨酸殘基進行翻譯後修飾（PTM）轉化為瓜氨酸（Cit，X）。高瓜氨酸（Hci，B）殘基是通過異氰酸與賴氨酸殘基的氨基或蛋白N-端的反應即氨基甲醯化形成的。根據異氰酸在碰撞誘導解離（CID）和高能碰撞誘導解離（HCD）中側鏈選擇性地丟失的特徵，可以實現對瓜氨酸化或氨基甲醯化和對肽進行測序的可靠鑑定。但是，由於醯胺鍵的裂解偏好不同，有時可能很難確定修飾位點，從而導致碎片離子系列不完整。另一方面，這些現象也可以產生有價值的結構信息。互補電子裂解策略也被廣泛使用，特別是在MS/MS中對大尺寸或高鹼性肽和蛋白的測序中。然而，在這些情況下，可用於鑑定的PTM特異性中性丟失可能是低豐度的。另一種有前景的技術是使用真空紫外光解離（VUVPD）在整個序列中隨機發生醯胺鍵裂解。
作者團隊先前研究是在電子轉移離解(ETD)中對與組蛋白相關五肽的瓜氨酸殘基進行選擇性中性丟失，結果證明電子轉移高能碰撞誘導解離（EThcD）對於提高碎裂效率和中性丟失的發生率都是有效的。他們還發現，瓜氨酸效應也被保留在EThcD中，即在（較高能量）碰撞誘導的解離（HCD，CID）中瓜氨酸殘基的C端裂解概率增加。
因此，作者團隊的目的是在保持較好控制的情況下表徵這些作用，尤其是集中於但不限於瓜氨酸和高瓜氨酸殘基C端的醯胺鍵。
他們選擇了序列AAXZAAK和AABZAAK，其中X和B分別代表瓜氨酸或高瓜氨酸，Z代表任何其他胺基酸，包括一些包含特殊修飾的胺基酸，如脲甲基半胱氨酸和氧化的甲硫氨酸，這些胺基酸經常出現在MS實驗中。Cys殘基的脲甲基化通常需要碘乙醯胺進行；但這可能會對蛋白質組學的識別率產生負面影響。最近，Wiśniewski等人，提出了一種僅需要減少Cys殘基不需烷基化的方法，提升了肽和蛋白質的鑑定。因此，他們在實驗中同時包含了Cys和尿素甲基化的Cys殘基。
根據Hao等人的研究，瓜氨酸殘基經過碰撞誘導的解離作用轉化為鳥氨酸（Orn，O）。據報導，氨基甲醯賴氨酸（Hci）殘基在CID後容易丟失異氰酸，產生賴氨酸（Lys，K）殘基。McGee和McLuckey觀察到Orn在其C端促進醯胺鍵的裂解。作者團隊還描述了Cit的C末端容易裂解的現象，這可以用異氰酸的損失和內醯胺的形成來解釋（圖1）。為檢查許多胺基酸殘基對酶切的影響，他們合成了總共225種模型肽段。
圖1. Cit或Hci肽的CID MS / MS片段化的兩步機制。（1）通過中性丟失異氰酸將Cit或Hci分別轉化為Orn或Lys。（2）通過δ-或ε-氨基對羰基碳的親核攻擊導致六或七元內醯胺衍生物的形成以及Cit-Zzz或Hci-Zzz醯胺鍵的斷裂。
實驗中，裂解得到含Cys，Met或Trp的七肽，而後為了產生脲甲基化的半胱氨酸殘基，將含有Cys的七肽通過在37°C下用二硫蘇糖醇（2μL，在水中200mM）處理30分鐘，並用碘乙醯胺還原烷基化，處理後樣品送入UPLC–MS / MS進行分析。
從UPLC–MS/ MS中提取源自雙電荷前體的串聯質譜，並通過mMass 5.5.0進行可視化處理，並使用5ppm的質量準確度限值自動在質譜圖中進行鑑定。僅考慮了主要碎片，並省略了與中性丟失相對應的峰。還考慮了同位素峰和帶多個電荷的碎片，手動檢查譜圖以排除假陽性情況。作者團隊使用軟體ROPstat對得到的結果進行統計分析。
先前的研究觀察到，Cit殘基在MS/MS中的C端增強了醯胺鍵的斷裂，於是作者團隊計算了在序列的第三和第四位上含有Cit和Hci殘基的一系列肽的所有醯胺鍵裂解率，並將它們與在這些位置上含有丙氨酸的變體進行了比較。作者團隊在Cit，Orn，Hci和Lys殘基之前和之後直接併入了所有可能的天然胺基酸以及氧化的蛋氨酸和脲甲基化的半胱氨酸，以評估由側鏈引起的斷裂偏好上的可能差異。
作為瓜氨酸作用的證明，AAXHAAK及其對照AAAHAAK的串聯質譜圖的比較可見於圖2，在Cit C末端的裂解的y4-b3離子的強度比對照的強度高19％。值得注意的是，Cit-His的裂解比His-Ala的裂解更多，而理論上His的殘基卻是更傾向於在C末端斷裂。
圖2. 證明瓜氨酸對模型肽AAXHAAK（A）和AAAHAAK（B）影響的MS / MS片段（15 eV）
作者團隊的統計結果發現，在10 eV時，第三位上的Cit殘基顯著增加了第三醯胺鍵的裂解。該效應在15 eV時也具有非常相似的強度，如圖3A 所示。
圖3. Cit，Orn，Hci和Lys對第三個醯胺鍵斷裂的影響（15 eV）
在15eV時，儘管對於大多數Z，Cit殘基處第四個醯胺鍵的斷裂優先級的增加是相當大的（圖4 A），但在10eV時與對照組相比只有很小的差異。這一結果表明，第四位上的Cit效應不那麼強，可以用次生碎裂過程解釋，即該過程只能在較高的碰撞能量下才能激活。
作者團隊還分析了分別含有Hci、Orn或Lys殘基的肽的數據（圖4 B/C/D），這些肽可通過原始序列中異氰酸的丟失而衍生。
圖4. Cit，Orn，Hci和Lys對第四個醯胺鍵斷裂的影響（15 eV）
應注意的是，rel％差異的最小值主要歸因於Arg和Ala殘基（X/ B / O / K位於第三位）。眾所周知，精氨酸會「螯合」質子並阻礙碎片化，因此給出較低的值。另一方面，在先前的研究中，丙氨酸對MS/MS片段化的影響較小，這也是作者團隊選擇丙氨酸作為對照的原因。然而，文章中的研究結果表明，至少在某些情況下，Ala殘基的N末端會出現裂解。當X / B / O / K位於第四位時，大多數His和Pro殘基的rel％差異最低。對於Pro殘基，在MS/MS中N端裂解優先級較高；而組氨酸在這些情況下也具有與Cit和Hci相當的類似作用。
當前，人們正在努力使用肽串聯質譜圖中給定片段的強度值來獲得可靠的結構鑑定，從而減少假陽性鑑定。特殊胺基酸或翻譯後修飾可改變肽的片段化過程，這些一影響可能改善或阻礙肽的檢測和鑑定。作者團隊的研究結果便證明了Cit殘基C末端較強的斷裂偏好。
在這項工作中，作者團隊量化了瓜氨酸和高瓜氨酸殘基對高能碰撞誘導的胰蛋白酶樣模型系統解離的影響，發現Cit殘基在統計學上和實際上都提高了C端的醯胺鍵裂解率，且其作用實際上與天然α-胺基酸（Z）的類型無關。在這項工作中，只有少數Cit-Zzz連接獲得了統計學上的較好結果，而Cit-Zzz連接是天然瓜氨酸化肽中最普遍的連接。此外，僅當Hci在序列的第三位時，高瓜氨酸殘基才產生相當大的作用，這可能表明Hci的影響作用遵循的機制較弱。當Cit或Hci離C端越遠，Cit和Hci的作用似乎都越強；Cit和Hci殘基（以及Orn和Lys）也總是在其N端抑制裂解。
這些結果有助於解釋含有尿素部分的肽的片段化過程，並通過將這些發現整合到軟體算法中，改進基於串聯質譜的蛋白質組學鑑定方法。
撰稿人：劉玉 遊楠
編輯：李惠琳
文章引用：ArnoldSteckel; Adina Borbély; Katalin Uray; Gitta Schlosser*, Quantification of theEffect of Citrulline and Homocitrulline Residues on the Collision-InducedFragmentation of Peptides. Journal of the American Society for MassSpectrometry, 2020.
參考文獻
[1] ArnoldSteckel; Adina Borbély; Katalin Uray; Gitta Schlosser*, Quantification of theEffect of Citrulline and Homocitrulline Residues on the Collision-InducedFragmentation of Peptides. Journal of the American Society for MassSpectrometry, 2020.