豬丁型冠狀病毒又稱豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV），是一種新發現的冠狀病毒，它主要感染整段小腸，尤其是空腸和迴腸，引起嚴重的腸炎並伴有小豬的腹瀉和嘔吐。2009—2010 年PDCoV 在中國香港首次報導該病毒。2014年初，在美國首次報導豬群該病的流行，此後至少有19個州有該新型冠狀病毒的報導。在美國，豬丁型冠狀病毒感染與豬流行性腹瀉（PED）和豬傳染性胃腸炎（TGE）的臨床發病情況比較相似，但是發病症狀相對較輕。新型豬腸道冠狀病毒病可引起乳豬腹瀉和嘔吐，發病率和死亡率高達50% -100%，生長豬和成年豬感染後死亡率低。現將本次病例報告如下。
材料與方法
病料
來自華南某集約化豬場（2000頭基礎母豬）3～7日齡的乳豬5頭，全場乳豬發生嚴重腹瀉，傳播迅速，發病率90%、死淘率90%以上。採集發病豬的小腸，按1：5研磨製備成病料，-80℃凍存待檢。
主要試劑
RNA抽提試劑盒購於上海A公司，反轉錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTP、18T載體克隆試劑盒、DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒、DH5α感受態細胞等購自TAKARA公司。
引物設計與合成
本實驗室根據GenBank 所發布的序列號，選擇N基因，運用Primer Premier5.0分別針對PDCoV、PEDV、TGEV、和RTV（豬輪狀病毒）設計4對引物，由B公司合成，預計擴增的特異性基因片段大小為482 bp、450 bp、810 bp 和620 bp。
總RNA 的提取
病料經離心取上清液，按照ANYGEN 核酸提取試劑盒說明書提取病毒總RNA，然後用物RNA 酶的水溶解，放在-80℃保存。
RT-PCR 的檢測
反轉錄體系：ddH2O 4 μL，下遊引物R 1μL，RNA1μL，70 ℃水浴10 min 冰浴2 min ；5×MLV buffer 2μL，ddH2O 1μL，dNTPs 0.5μL，RNA 酶抑制劑 0.25μL，MLV 反轉錄酶 0.25μL，42 ℃水浴1 h，72 ℃水浴15 min冰浴至冷卻。PCR 體系：ddH2O 32.5μL，10×MLV buffer 5μL，dNTPs 4μL，F 2μL，R2μL， cDNA 4μL，rTaq 0.5μL。反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30Cycles ，72 ℃ 7 min，PCR 反應產物於1.0% 瓊脂糖凝膠電泳。
克隆
將陽性PCR 產物經純化回收後與PMD-18T 載體連接，轉化到大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，培養後挑單個菌落進行PCR 鑑定，鑑定成功的重組質粒送往B公司進行測序。
序列分析
將RT-PCR 擴增獲得的N 基因進行克隆、測序， 利用MEGA6 軟體處理，與GenBank 上已公布的PDCoV 毒株的N 基因序列（表1）進行同源性比對分析，並繪製系統進化樹。
結果與分析
病豬症狀和病變
該集約化豬場5至15日齡乳豬發生傳播迅速的嚴重腹瀉，迅脫水死亡，死淘率高達90%以上。症狀見剖檢病變見圖1和圖2。主要在小腸,腸管明顯擴張, 內充滿黃色液體, 腸壁變薄、鬆弛、小腸黏膜充血, 腸繫膜呈索狀充血。
4種病毒N 基因擴增
應用RT-PCR 方法對樣品進行了PEDV/TGEV/RV/PDCoV 檢測，結果顯示PEDV/TGEV/RTV 未能擴增出目的條帶，而PDCoV 擴增出與預期大小一致片段，約482 bp，電泳圖見圖3。檢測結果顯示該病料PEDV/TGEV/RTV 為陰性，PDCoV 為強陽性，說明該豬場可能存在PDCoV 的感染。
PDCoV N 基因序列分析
由測序結果可知，Ch-A測序的N 基因中間存在一個核苷酸的缺失、幾個突變。運用DNAstard 軟體將測序正確PDCoV N 基因序列與GenBank 上已發表的國內外毒株N 基因參考序列進行同源性比對分析，結果顯示獲得PDCoV 毒株N 基因之間的核苷酸序列同源性為98.3%到100%，胺基酸序列同源性為95.0%到100% ；其中TX 與中國已公布毒株相比核苷酸同源性為98.3%到99.0%，胺基酸同源性為95.0% 到96.9%，顯示與中國香港毒株HKU15-155 同源性最低；與韓國和美國毒株相比核苷酸同源性為98.8%-99.0%，胺基酸同源性為96.2% 到96.9%（結果見圖4、圖5）。
PDCoV N 基因遺傳進化分析
運用MEGA 6.06 軟體繪製N基因系統進化樹，結果表明我國新出現的豬丁型冠狀病毒（Ch-A）與國內外報導的豬丁型冠狀病毒親緣關係較遠，它單獨在一個新的分支上。說明這是在我國新發現的一個新毒株（結果見圖6）。
討論
自2013年至今，新出現的PEDV 和PDCoV 已遍布美國，造成大量豬死亡。目前國際上正在形成該病毒相關研究熱點，也發表了少量的報告。但國內至今未見該病毒為主因在豬場暴發和流行的報導。
我們首次報導了國內集約化豬場暴發豬丁型冠狀病毒病。通過設計4對冠狀病毒引物，在檢測PEDV、TGEV 和RTV為陰性後，進一步設計引物擴增PDCoV，顯示為強陽性。對PDCoV HN 株的N 基因進行測序，並與國內外已公布的序列進行系統進化樹分析，結果顯示：該PDCoV 毒株（Ch-A）與GenBank 上公布的美國株及中國株不在一個分支上，是新發現的一株新型冠狀病毒病。該分支的毒株是否與本次發病的高致病力有關值得深入研究。仍然未知該病毒是怎麼傳入我國及其在我國各地的感染情況。
老病未消除、新病湧現，需高度重視和立即加強研究對豬丁型冠狀病毒的監測和系統性研究，降低給養豬業帶來的損失和威脅。
原標題：我國新發現豬丁型冠狀病毒病,應重點監測和系統性研究,減少豬場損失!
作者：賀東生、陳小芬、王飛等
來源：《豬業科學》，僅供參考
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