美國加州大學舊金山分校免疫學與微生物學系聯合加州大學舊金山分校生物化學與生物物理學繫於2013年10月在國際期刊《Science》上發表了題為"Following Gene Duplication, Paralog Interference Constrains Transcriptional Circuit Evolution"的研究論文。
基因複製是一個新基因的重要來源，大多數基因複製模型假設複製前基因的祖先功能是獨立的，因此後代的旁系之間可以整齊地劃分。然而，許多基因產物，如轉錄調節因子這種蛋白質的複製和分化的一個自然結果可能是同類之間的競爭幹擾。作者認為平行幹擾是基因重複進化的常見約束，解決它會產生額外的調控複雜性，需要穩定基因組中的重複基因。
Tips：
Mcm1是一種真菌的MADS-box轉錄調節因子，它與七個不同的轉錄調節因子協同結合DNA，控制許多基因的表達，包括編碼生殖功能和精氨酸代謝酶的基因。
Mcm1在精氨酸代謝（ARG）基因中的結構因真菌分支而異，在乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）和念珠菌（Candida albicans）中，Mcm1同源二聚體通過與輔助因子Arg81特異性結合來調節ARG基因的轉錄(圖1A)；在酵母（Saccharomyces cerevisiae）的世系中，Mcm1複製基因Arg80的引入使得酵母的調控結構更為複雜，Mcm1-Arg80異二聚體通過與輔助因子Arg81結合DNA來調節ARG基因的轉錄（圖1B），酵母中其他Mcm1調控的基因集在基因複製後並沒有經歷調控複雜性的增加（圖1C和D）。表明Mcm1和Arg80的基因調控都依賴於與輔因子和DNA形成的強烈相互作用。
圖1
為進一步探究Mcm1複製後DNA與輔助因子結合後功能是如何發生分化的，作者重組了原始的MADS-box蛋白，並在體內和體外對這些蛋白進行了分析。將重組的原始MADS-box蛋白整合到酵母中，並移除ARG80和MCM1，以確定原始蛋白是否可以彌補缺失。結果顯示複製前AncMADS蛋白彌補了這兩個缺陷:用AncMADS替代Mcm1或Arg80在任何以精氨酸前體作為唯一氮源的培養基中的生長都沒有影響，其表型依賴於正常的ARG基因調控（圖2A）。通過測定Mcm1和Arg80/Mcm1調控基因的表達水平，發現AncMADS恢復了這些基因的激活和抑制，並且大多數基因表現出與野生型相同的動態範圍（圖2B）。但ARG抑制基因的動態表達範圍縮小，α特異性基因的動態表達範圍輕度縮小，ARG激活基因CAR2的激活強於野生型（圖2B-E）。表明AncMcm1和AncArg80發生了退化突變，因此在進化過程中這兩個旁系同源基因都必須被保留。
圖2
通過探究AncMADS複製後AncMcm1和AncArg80多樣化的突變，發現從AncMADS到AncMcm1的世系中，發生了一個替換（Tyr33→Phe33），且Mcm1後代中都保存了這個基因；在AncMADS到AncArg80世系中，有3個序列在Arg80後代序列中高度保守(圖3A)。研究表明，一些殘基(T41A, Q42N, F62L; T, Thr; A, Ala, Q, Gln; N, Asn; L, Leu)在穩定Arg81和Arg80以及Mata1和Mcm1之間的相互作用中發揮了關鍵作用。為探究其對複製前祖先的影響，文章將這些突變引入到AncMADS中，觀察它們對ARG基因和α-特異基因表達水平的影響。結果表明，複製前AncMADS可以與Arg81和Mata1同時形成輔因子相互作用，並且這些相互作用在後代旁系中相互退化:AncMcm1失去了與Arg81有效交互的能力，而AncArg80失去了與Mata1交互的能力（圖3）。
圖3
Arg80和Mcm1具有非常密切的DNA結合特異性，表明在複製之後，MADS-box與DNA結合特異性的差異最多是有限的。複製前AncMADS蛋白可以彌補複製後基因的缺失，這也證實了DNA結合特異性沒有發生實質性變化(圖2)。然而Arg80對DNA的親和力遠低於Mcm1。為確定親和力變化發生的時間，測定AncMADS、AncArg80和AncMcm1在DNA上的半衰期，通過使用一種酵母的MADS-box結合位點（一個精氨酸代謝基因），該位點與酵母的Mcm1和Arg80的一致位點很相似，而且該位點已被證明支持這兩種蛋白在體外結合。結果顯示AncArg80的半衰期明顯低於AncMADS和AncMcm1的半衰期(圖3D)。因此，Mcm1和Arg80親和力的差異是由於複製後不久Arg80 的DNA結合親和力降低(圖3E)。
文章還探究了Arg80與DNA結合親和力降低對基因表達的影響，作者推測具有完全DNA結合強度的Arg80可能通過與α特異性基因調控位點結合幹擾Mcm1，並通過阻止Mcm1與Mata1協同結合而充當顯性負突變體(圖4A)。
那麼Arg80與DNA結合親和力的降低將通過α特異基因上的DNA結合來減少競爭，從而有利於Mcm1。通過逆轉AncArg80中的5個突變（K1Q，E2A，E7P，F10Y，K25R；K，Lys；E，Glu；P，Pro；R，Arg），在缺乏Arg80的酵母中測定α特異性基因的表達。根據旁系同源基因幹擾的假說，AncArg80突變體顯著降低了α特異性基因的表達，當過表達時，非突變的低親和力AncArg80蛋白抑制了α特異性基因的表達，而過表達的高親和力AncArg80突變幾乎完全阻斷了α特異性基因的表達(圖4B)。Arg80和Mcm1之間的拮抗作用以減弱的形式持續存在，因為酵母中Arg80的缺失會略微增加α特異性基因的表達(圖4B)。推斷Arg80與DNA結合親和力的降低限制了α特異性基因上Arg80和Mcm1之間的旁系同源基因的幹擾程度。
圖4
本文通過將原始基因重組並運用酵母相關的生化和遺傳研究方法相結合進行探究，邏輯清晰，故事完整，雖然尚不清楚影響蛋白質間相互作用的突變是發生在之前還是之後，抑或是與影響DNA結合的突變同時發生，但不可否認的是每一種突變都是一種功能缺失或者至少是功能減少的胺基酸替代，文章研究思路值得借鑑，通過關鍵位點的突變實現功能變化並進一步探究其進化機制，可以作為研究範例進行參考。
基因重複使蛋白質失去祖先的相互作用，導致亞功能化，不可避免地在重複之間會產生負面影響，雖然這種幹擾可以被利用，但更常見的結果是在進化過程中持續存在的基因重複中，這種幹擾被最小化。與此同時，這種最小化是否又伴隨著更加複雜的機制？這也為相關方面的研究提供了一個新的思路。
原文連結：
https://science.sciencemag.org/content/342/6154/104
—— 評論人：楊鈞賀 ——
—— 校對：韓方旭，周彪 ——
—— 編輯：左權 ——