來源：丁香園論壇 2007-07-28 23:27
在細胞復甦過程中，有多次復甦失敗，最終在查閱了相關技術積累了足夠的復甦技能後復甦成功，現將細胞復甦的操作程序和注意事項總結如下，望能為同行提供些參考。
【材料】
1. 常規細胞培養儀器設備 恆溫水浴振蕩器。
2. 培養液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞碸（DMSO）
【操作程序】
1. 細胞實驗室進行常規消毒，紫外照射40min以上。
2. 培養液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恆溫水浴箱370C預熱20min，備用。
3. 二甲基亞碸（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，備用。
4. 從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。
5. 將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min，5min）。
6. 用培養液懸液混懸沉澱細胞，調整細胞濃度，方培養箱中培養。
7. 記錄復甦日期。
【注意事項】
1. 取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
2. 凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這裡不作詳述，但二甲基亞碸（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞碸對細胞的毒副作較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。如果復甦溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞碸（DMSO）最好選擇進口產品。
3. 離心前須加入少量培養液。細胞解凍後二甲基亞碸濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。
4. 離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍後的細胞懸液直接吹打均勻後分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易汙染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞碸（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心後的液體前倒淨，且一定倒乾淨。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行復甦，結果無有異常。
5. 細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養液，而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
6. 復甦細胞分裝的問題：試驗中我的經驗總結為復甦1管細胞一般可分裝到1-2隻培養瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利於細胞的貼壁。
7. 加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那麼DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小於0.5%的時候對一般細胞沒有什麼影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是10％DMSO的話那麼加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。
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