No.135 | HPLC 和 UHPLC之間的方法轉換

2021-02-12 大曹色譜

我們在實驗過程中經常遇到這樣的問題：

實驗室新買了UHPLC,想要將原來的HPLC方法轉移到新的機器上,卻不知道該怎麼著手？

在文獻中查找到一個UHPLC建立的快速分析方法，如何將這個方法轉移到僅有HPLC的實驗室呢？

今天YoYo老師來為大家講一講，HPLC和UHPLC之間的方法轉換時應該注意哪些問題？怎樣來選擇合適的色譜柱？

1. 方法轉換中的不可變條件

2. 方法轉換中的變化條件 

3. 方法轉換中的基本調整規則

在方法轉換的時候，為了達到良好的分離情況，我們應該儘可能保持與HPLC分析方法中的主要分離條件一致。

(1) 在色譜柱中使用填料的性質和選擇性應當相同。

(2) 使用的流動相組成（強洗脫有機溶劑、緩衝物組成、pH等）應該相同。

(3) 檢測器的工作條件（檢測波長）應該相同。

(4) 柱溫應當相同。

方法轉換的過程中，通常是通過更換與UHPLC系統相匹配的，具有相同分離性能的色譜柱規格，調整流速來提高分離效率。

以下幾點是我們需要特別注意的地方。

(1) 填料的粒徑由大變小。

(2) 色譜柱的內徑由寬變窄。

(3) 色譜柱的長度由長變短。

(4) 色譜柱的壓力降由低變高。

(5) 色譜儀系統的死體積和梯度滯留體積由大變小。

(6) 流動相的流速由大變小。

(7) 洗脫時間由長變短。

現在，大家已經了解 HPLC→UHPLC 方法轉換時應該注意的可變條件和不可變條件了，那麼具體怎麼操作呢？

下面讓我們通過一個例子來掌握這項實用的工作技能吧。

例如，一個HPLC分析方法，使用色譜柱的規格是 4.6mm×250mm×5um；流速為1mL/min,柱壓為10Mpa,進樣體積為10uL.

那麼，如果換成粒徑為2um的UHPLC柱，柱長、流速、壓力、進樣量該如何來選擇呢？

首先引入一個分離效能的概念：

Se=L/dp

式中，L為色譜柱的柱長,mm;dp為色譜柱粒徑,um。

對於不同的色譜柱，只要能保持柱長和粒徑的比值相同，那麼分離效果就是差不多的。

柱長的計算：

L2=L1×(dp2/dp1)

L2=250×(2/5)mm=100mm

根據以上計算結果，我們就可以選擇規格為2.1mm×100mm×2um的CAPCELL PAK IF2 色譜柱了。

我們還是利用上面這個例子，現在規格選好了，那麼流速設置多少更合適呢？

式中，F為流速，dc為色譜柱內徑，dp為填料的粒徑。

F2=1×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(5/2)mL/min=0.52mL/min

根據以上計算結果，我們可以將流速設置為0.52mL/min.

按上述計算方法，確定色譜柱規格和流速以後，在估算色譜柱的壓力時，可以僅考慮填料粒徑的影響，近似式為

p2=10×(5/2)×(5/2)Mpa=62.5Mpa

CAPCELL PAK  IF2 具有超高的耐壓性能，耐壓可達100Mpa，完全符合替換要求。

V2=10×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(100/250)=0.83uL

YoYo老師在這裡留個思考題：

色譜柱規格變化之後，為什麼要調整進樣量呢？

您可以根據自己試驗的實際情況或檢測限的要求來調整進樣量。

這個開始看似很複雜的方法轉換問題，經過我們一步一步地計算，是不是變得很簡單了呢？

如果您現在正好有HPLC的項目，可以自己嘗試轉化成UHPLC方法，不僅可以提高分離效率，還能省下不少試劑呢！

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