Cell:調控哺乳動物基因表達的分子開關

2021-01-18 生物谷

生物谷報導：研究人員研製出一種分子開關，能夠可逆控制哺乳動物基因的開啟和關閉，控制基因的表達水平，將對生物學過程和疾病相關基因的研究的精確度提高到一個更高的水平。詳細內容刊登於上周Cell。

作者對這項研究「允諾了很多，」明尼蘇達大學Perry Hackett（未參與研究）說，「他們兌現了允諾。」

研究小組帶頭人、波士頓大學James J. Collins說，控制基因表達的三種傳統技術都有局限性。遺傳學技術使「敲除」變得不可逆，因此研究基因在發育過程不同時間點的功能變得很困難。利用小分子（如四環素）的方法不能完全阻斷靶蛋白的表達。RNA幹擾（RNAi），利用小RNA阻斷mRNA功能的技術，只是部分阻斷表達，而且經常阻斷與靶基因序列相似的基因的表達。

Collins與其同事採用一種合成生物學方法，將這三種技術的主要元件整合為一個基因調控系統。儘管這三種方法單獨使用時，只能部分阻斷基因的表達，但整合後會將表達降低到可忽略不計的水平。

當此開關關閉，系統表達一種抑制蛋白，將靶基因維持在關閉狀態。小發卡RNA（short hairpin RNA ，shRNA）提供了第二道關卡，阻斷漏網之「靶基因」。

開關能夠被一個小的化學誘導物打開。誘導物會關閉抑制蛋白的表達，打開另一種阻斷shRNA基因的抑制蛋白。兩道關卡都被打開後，目的基因得以表達，mRNA得以翻譯。完全開啟或者關閉的整個過程需要三天時間，但某些效果在幾小時內便「顯而易見」。

「想像一下用我們這種開關控制一個在發育晚期表達的目的基因，」Collins說，「你會希望能夠在發育的關鍵階段將其關閉，在另一階段將其打開。現有技術無法實現將其完全關閉，除非將此基因徹底敲除。」

他們利用幾種實驗室培養的細胞系，在幾種基因上檢測這種系統。在以表達白喉毒素(Diphtheria toxin,DT)A片段(DTA)的細菌基因為靶基因的檢測中，DTA的表達受到緊密調控：一個DTA分子足以殺死細胞，但胞內無DTA的細胞卻不受任何影響。

Hackett注意到，此開關的關鍵優勢在於，能夠通過定量控制誘導物分子的表達而精確控制靶基因的表達水平，而且是可逆性控制。

由於其模塊性質，此開關能夠對任何目的基因進行控制。Collins說。「比如，我們能夠用組織特異的啟動子研製新的動物模型，」他還認為這種系統能夠被實驗室以外的研究採用，可能為遞送基因試劑提供一種自動防故障途徑。

原始出處:

Cell, Vol 130, 363-372, 27 July 2007

Resource

A Tunable Genetic Switch Based on RNAi and Repressor Proteins for Regulating Gene Expression in Mammalian Cells

Tara L. Deans,1 Charles R. Cantor,1 and James J. Collins1,

1 Department of Biomedical Engineering, Center for BioDynamics and Center for Advanced Biotechnology, Boston University, Boston, MA 02215, USA

Corresponding author
James J. Collins
jcollins@bu.edu

Here, we introduce an engineered, tunable genetic switch that couples repressor proteins and an RNAi target design to effectively turn any gene off. We used the switch to regulate the expression of EGFP in mouse and human cells and found that it offers >99% repression as well as the ability to tune gene expression. To demonstrate the system's modularity and level of gene silencing, we used the switch to tightly regulate the expression of diphtheria toxin and Cre recombinase, respectively. We also used the switch to tune the expression of a proapoptotic gene and show that a threshold expression level is required to induce apoptosis. This work establishes a system for tight, tunable control of mammalian gene expression that can be used to explore the functional role of various genes as well as to determine whether a phenotype is the result of a threshold response to changes in gene expression.

調控基因表達的 miRNA 

micro  RNAs  (miRNAs)  是一類長約22核苷酸的非編碼的單鏈  RNA  分子，它們廣泛存在於從植物、線蟲到人類的細胞中。最早發現的是  lin-4  和它的靶  mRNA，即  lin-14。1993年，Lee  等人用經典的定位克隆的方法在線蟲  (C.  elegans)  中克隆了  lin-4  基因，並通過定點突變發現  lin-4  並不編碼蛋白，而是產生一種小  RNA  分子。這種小  RNA  分子能以不完全互補的方式與其靶  mRNA  的3'非翻譯端的特定區域相互作用來抑制  lin-14  的表達，最終導致  lin-14  蛋白質合成的減少，這種現象叫做轉譯抑制。通過轉譯抑制，  lin-4  控制著  C．elegans  幼蟲由  L1  期向  L2  期的轉化。為什麼一個只有22  nt  的  RNA  分子起著如此重要的調節作用？當時人們無法解釋，只能認為是一種稀少的個別現象。但是，2000年第2個  miRNA  let-7  及其人類和果蠅中同源物的發現改變了人們的看法，  miRNA  可能是一類進化上保守的、在生命中起著重要調控作用的分子。它們能有效地抑制相關蛋白質的合成，導致靶  mRNA  的降解，或者其他形式的調節機制來抑制靶基因的表達，產生基因沉默。近年來發現  miRNA  可能在基因表達調控領域中起著超乎想像的重要作用，miRNA  序列、結構、豐度和表達方式的多樣性，使其可能作為蛋白質編碼  mRNA  的強有力的調節子。miRNA  的發現豐富了人們對蛋白質合成控制的認識，補充了在  RNA  水平對靶  mRNA  分子進行更迅速和有效的調節，展現了細胞內基因表達調控全方位多層次的網絡系統。miRNA  的發現也是對中心法則中  RNA  次要的中介角色的重要補充，它將促使生物學家重新思考細胞遺傳調控及其發育等方面的重要問題。

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