來源：丁香園論壇 2006-12-22 20:26
二、雜交瘤技術
（一） 雜交瘤技術的誕生
淋巴細胞雜交瘤技術的誕生是幾十年來免疫學在理論和技術兩方面發展的必然結果，抗體生成的克隆選擇學說、抗體基因的研究、抗體結構與生物合成以及其多樣性產生機制的揭示等，為雜交瘤技術提供了必要理論基礎，同時，骨髓瘤細胞的體外培養、細胞融合與雜交細胞的篩選等提供了技術貯備。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英國《自然》雜誌上發表了題為「分泌具有預定特異性抗體的融合細胞的持續培養」（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤細胞與經綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合。融合由仙臺病毒介導，雜交細胞通過在含有次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培養基（HAT）中生長進行選擇。在融合後的細胞群體裡，儘管未融合的正常脾細胞和相互融合的脾細胞是HGPRT+，但不能連續培養，只能在培養基中存活幾天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤細胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤細胞不能在HAT培養基中存活，只有骨髓瘤細胞與脾細胞形成的雜交瘤細胞因得到分別來自親本脾細胞的HGPRT和親本骨髓瘤細胞的連續繼代特性，而在HAT培養基中存活下來。實驗的結果完全像起始設計的那樣，最終得到了很多分泌抗綿羊紅細胞抗體的克隆化雜交瘤細胞系。用這些細胞系注射小鼠後能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同質的抗體，即單克隆抗體。
這一技術建立後不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細胞系等方面即得到改進。最早仙臺病毒被用做融合劑，後來發現聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的汙染問題，從而得到廣泛的應用。隨後建立的骨髓瘤細胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，所以由它們產生的雜交瘤細胞系，只分泌一種針對預定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細胞MOPC-21等的不足。再後來又建立了大鼠、人和雞等用於細胞融合的骨髓瘤細胞系，但其基本原理和方法是一樣的。
（二） 基本程序和方法
雜交瘤技術在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節中介紹的方法是作者所在實驗室採用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內大多數實驗室。
在開展雜交瘤技術製備單抗之前，培養骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設備：超淨工作檯、CO2恆溫培養箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細胞培養瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青黴素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細胞培養板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細胞計數板，可調微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細胞的篩選與檢測的儀器設備，依據檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節有關部分。
淋巴細胞雜交瘤技術的主要步驟包括：動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、單抗的鑑定等，圖6-1概括了淋巴細胞雜交瘤技術研製單抗的主要過程。
1、動物免疫
(1) 抗原製備 製備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用於抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定於所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
(2) 免疫動物的選擇 根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源於BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源於LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便於操作。
(3) 免疫程序的確定 免疫是單抗製備過程中的重要環節之一，其目的在於使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利於細胞融合形成雜交細胞，並增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用於各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照製備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也採用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最後一次加強免疫多採用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇後者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最後一次加強免疫後第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞
融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度並無明顯的平行關係，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有儘可能多的漿母細胞，這在最後一次加強免疫後第3天取脾進行融合較適宜。已有人報導採用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天後即可融合。
表6-1 不同免疫抗原的免疫程序
免疫原特性 抗原量 接種次數 間隔時間 單抗的特性
抗體滴度 親和性
免疫原性強（如細胞、細菌和病毒等） 106-107個細胞或1-10ug 2-4
2-4周 高
中等至強
免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高 中等或強
免疫原性弱 A.20-400ug 2-4
隨後
2-3 每月
2-3月
中等
強
B.10-50ug
其後
200-400ug 2
其後
4 每月
每天 中等 中等
C.10-100ug 2
其後
4
其後「休息」
最後加強
每月
10天
1-2月
中等
中等或強
(摘自劉秀梵)
體內免疫法適用於免疫原性強、來源充分的抗原，對於免疫原性很弱或對機體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果製備人單克隆抗體幾乎不大可能採用體內免疫法。因此，針對這些情況，可採用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細胞（或淋巴結細胞，或外周血淋巴細胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養，然後再與骨髓瘤細胞進行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，製成單細胞懸液，用無血清培養液洗滌2-3次，然後懸浮於含10%小牛血清的培養液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細胞抗原105-106個細胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細胞培養上清液；在37℃，6%CO2濃度下培養3-5天，再分離脾細胞與骨髓瘤細胞融合。
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