華人學者Chuan-Yuan Li最新Nature

▲第一作者：Xinjian Liu，Xuhui Bao

通訊作者：Chuan-Yuan Li

通訊單位：美國杜克大學

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2911-7

背景介紹

儘管免疫療法成功地實現了10-30%的受試者的長期生存，但對大多數癌症患者來說，免疫療法仍然無效。因此，許多研究正在進行中，以確定新的方法來增強這種免疫檢查點療法（該療法的目的是阻斷抑制T細胞檢查點信號通路的蛋白質，從而使這些免疫細胞釋放到靶向癌細胞的目標上）。

本文亮點

● 本文表明，抑制PCSK9（一種調節膽固醇代謝的關鍵蛋白）可以通過一種獨立於PCSK9膽固醇調節功能的機制來增強腫瘤對免疫檢查點療法的反應。

● 敲除小鼠癌細胞中的PCSK9基因可以顯著削弱或阻止其在小鼠體內的生長，其方式依賴於細胞毒性T細胞。它還增強了針對檢查點蛋白PD1的免疫治療的療效。

● 此外，臨床認可的PCSK9中和抗體與抗PD1治療協同抑制小鼠腫瘤模型中的腫瘤生長。通過基因缺失或使用PCSK9抗體抑制PCSK9可增加腫瘤細胞表面主要組織相容性蛋白Ⅰ類（MHC-I）蛋白的表達，促進細胞毒性T細胞的瘤內浸潤。

● 從機制上講，作者發現PCSK9可以通過與MHCI的物理結合以及促進其在溶酶體中的重新定位和降解來破壞MHCI在細胞表面的循環。總之，這些結果表明，抑制PCSK9是增強癌症免疫檢查點治療的一個有希望的方法。

圖文解析

為了評估PCSK9對腫瘤生長的影響，作者使用CRISPR-Cas9技術敲除了4個小鼠惡性腫瘤細胞系(B16F10、4T1、MC38和CT26)中的PCSK9基因。為了確定免疫系統的參與，作者將pcsk9缺陷和載體控制4T1和B16F10腫瘤細胞接種到T細胞、B細胞和自然殺傷細胞缺陷的NCG小鼠中。

▲圖1、PCSK9缺失會降低同基因小鼠的腫瘤生長。將大約1x105個載體對照和相同數量的不同類型的pcsk9敲除小鼠腫瘤細胞皮下接種到同基因小鼠中，監測腫瘤形成情況。監測腫瘤大小和總生存率。a, b, 4T1乳腺癌系，在Balb/c小鼠中生長。c, d, B16F10黑素瘤系，在C57BL/6小鼠中生長。e, f, CT26結腸癌系，在Balb/c小鼠中生長。g, h, MC38結腸癌株，在C57BL/6小鼠中生長。

為了評估PCSK9缺陷是否能與免疫檢查點阻斷治療協同，作者使用小鼠抗PD1免疫檢查點抑制劑，在接種PCSK9缺陷的B16F10、MC38、4T1或CT26腫瘤細胞的同基因小鼠中進行腫瘤生長延遲實驗。

▲圖2 抑制PCSK9克服腫瘤對抗PD1治療的耐藥性。a-c，在同基因小鼠中用抗PD1抗體治療媒介控制和PCSK9敲除B16F10黑色素瘤。a、實驗方案；b，腫瘤生長曲線；c，總生存率。在同基因小鼠中用抗PD1抗體治療載體控制和PCSK9基因敲除MC38結腸癌。d、實驗方案；e，腫瘤生長曲線；f，總生存率。抗PCSK9抗體和抗PD1抗體聯合治療MC38結腸癌。g、實驗方案；h，腫瘤生長曲線；i，總生存率。

接下來，作者嘗試通過免疫螢光染色和流式細胞術定量對照組和pcsk9缺陷B16F10腫瘤中的免疫效應細胞。免疫螢光染色顯示，PCSK9缺失導致腫瘤內CD45+白細胞和CD8+細胞的整體浸潤增加。特別令人感興趣的是，CD8+細胞在對照組腫瘤中大部分仍位於外周，但在pcsk9缺失的B16F10腫瘤中移至腫瘤細胞豐富的區域。

▲圖3 PCSK9的缺失增強了腫瘤內T細胞的浸潤。a-e，通過流式細胞儀測定的載體對照和PCSK9基因敲除B16F10腫瘤組織中每毫克腫瘤組織中各種免疫效應細胞的定量評估。f、 對照組和PCSK9基因敲除B16F10腫瘤中CD8+細胞毒性T淋巴細胞（ctl）與CD4+Foxp3+Treg細胞的比率。g、h，對照組或PCSK9基因敲除腫瘤組織中每毫克腫瘤組織中浸潤IFN-γ+CD8+T細胞（g）和GZMB+CD8+T細胞（h）的平均數量。i、j，在缺乏CD8+T細胞的C57BL/6小鼠中，對照組和PCSK9基因敲除B16F10腫瘤細胞的腫瘤生長（i）和宿主存活率（j）。用TCR-βCDR3測序法，從對照組和PCSK9基因敲除腫瘤（o）和PCSK9基因敲除腫瘤（o）和PCSK9基因敲除腫瘤中最常見的5%的TCR的ko、總TCRs（k）、唯一TCRs（l）、生產克隆性（m）、最大生產頻率（n）和熱圖。p、定量評估活體對照或PCSK9基因敲除B16F10-Td番茄（Td）腫瘤細胞與激活的OVA特異性T細胞孵育24小時後剩餘的部分。q、食管癌（ESCA，47例）、宮頸鱗癌和宮頸腺癌（CESC，112例）、胰腺癌（PAAD，173例）和前列腺癌（PRAD，313例）中pcsk9mrna與CD8A呈負相關。

接下來，作者重點研究了CTL介導的PCSK9缺陷腫瘤細胞殺傷增強的分子機制。由於PCSK9在調控細胞表面蛋白(如LDLR17、32、33)水平方面的已知作用，推測PCSK9缺陷可能影響腫瘤細胞表面抗原提呈。事實上，與對照的B16F10卵母細胞相比，IFN-min刺激、pcsk9缺失、B16F10卵母細胞表面的H2-Kb MHC I分子結合SIINFEKL的染色明顯增強。因此，PCSK9對MHCI的肽抗原表達有很強的影響。進一步檢測了敲除PCSK9對體內生長的B16F10腫瘤細胞表面H2b MHC I同種異體抗原水平的影響。

▲圖4、PCSK9促進溶酶體介導的腫瘤細胞MHCI降解。a、對照組和PCSK9基因敲除B16F10細胞中SIINFEKL H-2Kb水平的定量評估。b，c，流式細胞術估計皮下生長的對照和PCSK9缺陷B16F10細胞表面H-2Kb/Db水平。d、組織培養對照和PCSK9缺陷4T1細胞表面mhci水平的定量評估。e、PCSK9基因缺陷對對照細胞和PCSK9基因敲除MDA-MB-231細胞表面HLA-A2表達的影響。f、外源性PCSK9蛋白對MDA-MB-231 PCSK9敲除細胞表面HLA-A2降解的影響。g、小鼠PCSK9和H2-K1在標記H2-K1聯合血凝素（HA）標記全長PCSK9或PCSK9的293T細胞中的相互作用。h、PCSK9促進了H2-K1向溶酶體的遷移。

MHCI（H2-K1標誌）在PCSK9（PCSK9-HA）過度表達或PCSK9基因敲除B16f10細胞中分布的典型螢光共聚焦圖像。i、j，上部分，western blot定量分析PCSK9過度表達和PCSK9敲除B16F10細胞的溶酶體（i）和質膜（j）部分中的H2-K1標誌。底部，MHCI（H2-K1標誌）表達水平的定量估計。k、左圖：用放線菌酮（CHX，k）或巴非黴素A1（BafA1，l）處理的載體對照和PCSK9基因敲除MDA-MB-231細胞中HLA-ABC表達的免疫印跡分析。右圖，基於免疫印跡分析的HLA-ABC水平定量估計。

原文連結：

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2911-7