科研成果 | 方顯楊課題組合作報導長鏈RNA位點特異性自旋標記新方法及其應用

近日，清華大學結構生物學高精尖創新中心方顯楊課題組與美國南加州大學化學系Peter Z. Qin教授課題組合作在《化學科學》（Chemical Science）雜誌發表了題為「基於非天然鹼基對系統的非變性條件下長鏈RNA轉錄後位點特異性自旋標記技術」（Posttranscriptional site-directed spin labeling of large RNAs with an unnatural base pair system under non-denaturing conditions）的文章。

電子順磁共振技術（Electron Paramagnetic Resonance, EPR）與核磁共振技術（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）類似，都是磁共振波譜學技術的分支。近年來，位點特異性自旋標記電子順磁共振技術（Site-Directed Spin Labeling Electron Paramagnetic Resonance, SDSL-EPR）已成為研究生物大分子（包括蛋白質, DNA, RNA等）的結構、動態特性與功能的重要技術。這項技術能夠在近生理條件下探測生物大分子不同功能狀態下的動態特性信息、提供自旋中心間20-100埃的距離信息、並且實時的檢測生物大分子的構象變化過程等。SDSL-EPR具有靈敏度高（相比於核磁共振）, 對生物大分子的分子量和均一性均沒有限制的優點，SDSL-EPR已日益成為重要的整合結構生物學研究工具。

由於大多數生物大分子是天然逆磁性的，開展SDSL-EPR研究的前提是向生物大分子特定位點引入一個或成對的自旋標記，這些自旋標記可以是自由基或順磁金屬離子。當前，蛋白質的位點特異性自旋標記技術已有很好的發展而相對成熟，而RNA，特別是長鏈RNA的位點特異性自旋標記仍十分具有挑戰性。例如，基於固相化學合成的標記方法主要局限於長度在100個核苷酸以下的短鏈RNA；基於DNA夾板指導的酶促連接法可實現長鏈RNA的位點特異性自旋標記，但其步驟往往十分繁瑣，還需要經歷變性復性過程，該方法不僅效率低，其變性過程常常導致長鏈RNA的不可逆錯誤摺疊。

針對現有RNA位點特異性自旋標記技術的局限性，方顯楊課題組利用包含NaM-TPT3非天然鹼基對的系統，通過化學合成鹼基帶有炔基修飾的TPT3（rTPT3CO）（圖1A），經過PCR和體外轉錄反應，在RNA中位點特異性的引入TPT3CO，進一步利用點擊化學反應的高選擇性，通過與疊氮基修飾的氮氧自由基化合物反應，建立了在非變性條件下長鏈RNA位點特異性自旋標記的策略，並被成功應用於長度為419核苷酸的核糖核酸酶RNAse P的位點特異性自旋標記中（圖1B）。通過與美國南加州大學化學系Peter Z. Qin課題組合作，應用連續波（CW）EPR 技術證實了該方法的高標記效率、 研究了標記位點附近的動態特性、以及用雙電子自旋共振（DEER） EPR技術測定了成對自旋中心間的距離（圖1C）。該標記策略的成功建立將促進SDSL-EPR技術在長鏈RNA的結構與動態特性研究中的應用，並推動建立長鏈RNA的整合結構生物學研究方案。