高效液相色譜儀性能的測試方法

一、範圍

本標準規定了高效液相色譜儀主要性能的測試方法。

本標準適用於高效液相色譜儀(HPLC)、超高效液相色譜儀(UPLC)。

本標準測試方法分為單元部件和儀器整機兩部分。

二、規範性引用文件

下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改版)適用於本文件。

GB/T 11606-2007 分析儀器環境試驗方法 GB/T 26792-2011 高效液相色譜儀

GB/T 25472-2010 色譜數據工作站 GB/T 30433-2013 液相色譜儀測試用標準色譜柱

GB/T 32267-2015 分析儀器性能測定術語

GB/T 9008-2007 液相色譜法術語 柱色譜法和平面色譜法

JJG 705-2014 液相色譜儀檢定規程 GB/T 6682-2008 分析實驗室用水規格和試驗方法

三、條件要求

3.1 儀器工作條件

環境溫度：15℃~35℃；

相對溼度：20%~80%；

供電電源：電壓 220 V±22V，頻率 50 Hz±0.5 Hz，並接地良好；

室內避免易燃、易爆和強腐蝕性氣體及強烈震動、電磁幹擾，有良好的通風裝置。

3.2 試驗條件

試驗用計量儀器、儀表和玻璃器皿等均按有關規定，經計量檢定單位檢定合格並滿足量程和精度的要求；

標準溶液與試劑：標準溶液應使用滿足相關標準的有證標準物質，並按照相關要求配製，各種試劑應使用優級純或分析純。

四、單元部件性能指標的測試

4.1 恆流泵

4.1.1 密封性

4.1.1.1 設備與試劑

高壓截止閥一個，耐壓不小於儀器壓力上限 120%；精密壓力表一個，量程不小於儀器壓力上限的 120%，0.4 級；三通一個；秒表一塊，分度值不大於 0.1 s。

純水：二次蒸餾水，滿足《GB/T 6682-2008 分析實驗室用水規格和試驗方法》中一級水要求，以下同。

4.1.1.2 測試方法

通過三通將恆流泵、高壓截止閥和精密壓力表連接，恆流泵最高壓力設定為儀器壓力上限90%處。以純水為流動相，待系統排出氣體，流量設置為 0.1 mL/min；運行儀器，將高壓截止閥處於截流狀態，壓力將逐漸上升，達到儀器壓力上限 90%時，停止運行；記錄此時壓力表示值 p1，保持 10min 後，記錄壓力示值 p2。按式(4-1)計算壓力降。

4.1.2 流量準確度與精密度

4.1.2.1 設備與試劑

秒表一塊，分度值不大於 0.1 s；帶探針數字溫度計一支，分度值不大於 0.1℃；分析天平一臺，根據流量大小選擇合適載荷，測試質量控制在天平載荷的 60%左右，準確度不低於 II級，實際分度值不大於 0.1 mg；背壓裝置一個，在設定流量下可提供(8±2)MPa 背壓；合適規格的稱量瓶三個。

純水。

4.1.2.2 測試方法

連接恆流泵入口、出口管路，以純水為流動相(將數字溫度計探針插入流動相內，測定此時流動相的溫度)，分別設定儀器流量上限的 1%、10%和 50%，調整背壓在(8±2)MPa。待儀器運行穩定後，按照表 1 要求收集流動相，採用秒表計時，記錄數據。分別按照式(4-2)、式(4-3)計算流量準確度和精密度。

註：流量的設定可根據恆流泵的流量範圍而定，此處以流量上限為10 mL/min為例。

註：為方便起見，亦可採用檢定合格的液體流量計(精度不低於0.01 mL/min)測試流量準確度與精密度。

4.1.3 壓力脈動

4.1.3.1 設備與試劑

精密壓力表一個，量程不小於儀器壓力上限的 120%，0.4 級；背壓裝置一個：在設定 1.0 mL/min 流量下，在 0~30 MPa 範圍內可調；秒表一塊，分度值不大於 0.1 s。

純水。

4.1.3.2 測試方法

依次連接恆流泵、精密壓力表、背壓裝置入口與出口管路，以純水為流動相，設定流量為儀器流量上限的 10%，調整背壓為儀器壓力上限的 20%左右(如儀器壓力上限為 40 MPa，則背壓調整在(8±2)MPa；如儀器壓力上限為 100 MPa，則背壓調整在(20±2)MPa)。待儀器運行穩定後，監測精密壓力表示值，記錄 10 min 內的最大、最小壓力值及平均值(每間隔 1 min 讀數一次，計算平均值)。按照式(4-4)計算壓力脈動率δp。

4.2 自動進樣器

4.2.1 進樣準確度與精密度

4.2.1.1 設備與試劑

分析天平一臺，準確度不低於 II 級，實際分度值不大於 0.1 mg；2 mL 樣品瓶若干。

純水。

4.2.1.2 測試方法

啟動自動進樣器，排除管路氣泡，清洗進樣針，取 2 mL 的進樣瓶，加入一定量的純水，用分析天平稱量，記錄數據。按表 2 執行取樣，每次取樣結束後，均對進樣瓶進行稱量，記錄數據。按式(4-5)和式(4-6)進行計算 SS 和 SR，作為進樣準確度與精密度*。

4.2.2 線性

4.2.2.1 設備與試劑

同 4.2.1.1。

4.2.2.2 測試方法

同 4.2.1.2，依次設定進樣體積為 5uL，10uL，20uL，25uL，50uL(如樣品環體積為 100 uL)，每個體積連續測量三次，記錄數據，取算術平均值 m，與對應的取樣體積作一元線性擬合校準曲線，得出線性相關係數 r。

4.2.3 殘留

4.2.3.1 設備與試劑

高效液相色譜儀系統一套，C18 色譜柱一支(滿足《GB/T 30433-2013 液相色譜儀測試用標準色譜柱》標準要求，理論塔板數不低於 18000，以下同)。

0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液；85%甲醇水溶液。

4.2.3.2 測試方法

將自動進樣器連入測試用高效液相色譜儀系統中，採用 C18 色譜柱連接自動進樣器出口與檢測器入口，啟動儀器，設置檢測器波長為 254 nm，以 85%甲醇水溶液為流動相，流量設定為 1.0 mL/min，平衡系統。啟動進樣器，排除管路氣泡，清洗進樣針，取 2 mL 的進樣瓶，加入一定量的 0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液，放入自動進樣器託盤指定位置。設置自動進樣器參數，進樣前後各清洗 1 次(清洗體積為系統體積的 3~5 倍)，依次注入 20uL 的 0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液和 100%甲醇溶液。重複測量三次，記錄色譜峰面積，取算術平均值，按式(4-7)計算殘留量。

4.2.4 最小進樣時間

在色譜數據工作站上設定分析方法，編輯序列，進樣量設為 20uL，選擇不洗針模式，點擊運行序列，同時用秒表計時，至完成進樣，色譜工作站開始採集數據為止，記錄此過程的時間為最小進樣時間。

4.3 色譜柱恆溫箱

4.3.1 溫度準確度與精密度

4.3.1.1 設備與試劑

校準過的帶探針數字溫度計一臺，分度值不大於 0.1℃；空色譜柱管一支。

4.3.1.2 測試方法

將數字溫度計探針放置在一支空色譜柱的中心，將空色譜柱固定在色譜柱溫箱內放置色譜柱處，選擇 4℃(製冷 1)、室溫+10℃，40℃，溫度上限的 90%進行測量。按溫度從低到高順序升溫，開機加熱或製冷 60 min 後，每隔 5 min 記錄一次數字溫度計顯示溫度 2，測試五次計算平均值。按照公式(4-8) 和( 4-9)計算溫度準確度與精密度。

式中：

ts —溫度設定值誤差，作為溫度準確度，℃；

—為5次測量的平均值，℃；

t0—溫度設定值，單位為攝氏度（℃）；

tc —控溫穩定性，作為溫度精密度，℃；

tmax —x次測量最大值，℃；

tmin ——n次測量最小值，℃

注1：如色譜柱恆溫箱具有製冷功能時，才需測試； 注2：亦可通過計算機軟體實時檢測溫度變化曲線，待儀器穩定後，記錄溫度曲線，計算溫度準確度與精密度。

4.4 檢測器

4.4.1 通用性能指標

4.4.1.1 靜態基線噪聲與漂移

(1)設備與試劑

色譜數據工作站一套，純水。

(2) 測試方法

按照表3要求，設定儀器參數，連接測試系統。開機預熱60 min後，記錄基線60 min；取60 min內平行包絡線的中心線的起點與終點的差值作為檢測器的基線漂移(如圖1所示)；選取所記錄基線中噪聲較大的5 min作為計算噪聲的基線，以1 min為界畫平行包絡線(如圖2所示)，按式(4-10)計算短期基線噪聲。5個包絡線寬度的平均值，作為檢測器基線噪聲。

圖1 基線漂移計算示意圖

圖2 基線噪聲計算示意圖

4.4.1.2 信噪比

(1)設備與試劑

色譜數據工作站一套；二元梯度系統一套(梯度誤差不大於±1%)或1 mL注射器一支；試劑：按照表4配製標準樣品。

(2)測試方法

將檢測器與二元梯度系統，以及色譜數據工作站連接好，按照表3設置儀器參數。開機預熱後，以甲溶液為流動相A注入，1.0 mL/min的流量平衡系統，衝洗流通池至示值穩定後歸零。然後以乙溶液為流動相B注入流通池，檢測器示值穩定後記錄響應信號值，重複測試三次，取算術平均值。然後按式(4-11)計算信噪比(S/N)，噪聲計算方法參照4.4.1.1。

.................................... (4-11)

式中：

S/N—檢測器信噪比；

H—檢測器信號響應值；

N—基線噪聲。

表4 不同類型液相色譜檢測器信噪比、線

4.4.1.3 線性範圍與靈敏度

(1)設備與試劑

色譜數據工作站一套；1 mL 注射器一支；試樣：按照表 4 配製 1 個空白甲溶液，配製 10個系列濃度丙溶液。如紫外-可見檢測器配製試樣甲溶液：純水；試樣丙溶液：丙酮水溶液濃度依次為 0.1%、0.2%、0.3%、、1.0%。

(2)測試方法

將檢測器和色譜數據工作站連接好，按照表3設置儀器參數。開機預熱後，用注射器直接向檢測池內注入表4甲溶液，衝洗檢測池至示值穩定後將檢測器回零。然後向檢測池內依次注入表4乙溶液，充滿檢測池並使示值穩定，記錄各濃度下的響應信號值，每個濃度重複測試三次，取算術平均值。以前五個濃度點和對應響應信號值作標準曲線，計算出後五點的理論響應值，與對應含量的響應信號值比較，響應信號值剛好大於計算值5%時，認為曲線彎曲，此點濃度作為線性上限CH。 CL值測定(信噪比推算法)： 以4.4.1.2測得結果線性推算信噪比為3時對應的濃度，即作為線性下限CL。

最後，由CH/CL算出檢測器線性範圍，CH值測定時標準曲線斜率作為檢測器靈敏度。

4.4.2 紫外-可見檢測器/二極體陣列檢測器

4.4.2.1 波長準確度與精密度

(1)設備與試劑

色譜數據工作站一套，1mL注射器一支,氧化鈥濾光片或0.4%氧化鈥的10%高氯酸溶液：特徵波長為242 nm，361 nm，536 nm。另外，亦可參照GB/T 26792-2011，採用0.0601 mg/mL重鉻酸鉀的0.05 mol/L硫酸溶液(紫外吸收波長標準溶液，特徵波長為235 nm，257 nm，313 nm和350 nm)測試。

(2)測試方法

將檢測器和色譜數據工作站連接好，開機預熱穩定後，將氧化鈥濾光片放置在流通池處或將0.4%氧化鈥的10%高氯酸溶液注入流通池進行光譜掃描，重複測試三次，記錄並保存，計算譜線波峰的波長示值與特徵波長值之差。按照此法依次檢驗各個特徵波長的示值誤差，取其中最大值作為檢測器波長準確度。計算重複三次中最大值與最小值之差作為檢測器波長精密度。

4.4.3 示差折光檢測器折光響應值準確度

4.4.3.1 設備與試劑

色譜數據工作站一套；1 mL 注射器一支或恆流泵一臺；0.872 mg/mL 丙三醇水溶液（對應響應值為 1×10-4RIU）和 0.436 mg/L 丙三醇水溶液（對應響應值為 5×10-5RIU）.純水。

4.4.3.2 測試方法

將檢測器和色譜數據工作站連接好，開機預熱，首先將純水注入參比池和樣品池，衝洗穩定後歸零；然後將 0.436 mg/L 和 0.872 mg/L 丙三醇水溶液依次注入樣品池，示值穩定後，記錄響應值，重複三次取算術平均值，最後與標準值比較，計算 RIU 與 mV 的對應關係。

4.4.4 螢光檢測器波長準確度與精密度

4.4.4.1 設備與試劑

色譜數據工作站一套，1 mL 注射器一支。

純水，或者 1×10-4 mg/mL 萘甲醇溶液。

4.4.4.2 測試方法

將檢測器和色譜數據工作站連接好，開機預熱穩定後，向檢測池內注入純水，待檢測器示數穩定後，分別設定純水拉曼光譜的激發/發射特徵波長為 350 nm/397 nm，進行激發和發射光譜掃描，重複測試三次，記錄並保存光譜圖。按照此法依次檢驗各個特徵波長的示值誤差，取其中最大值作為檢測器波長準確度。計算重複三次中最大值與最小值之差作為檢測器波長精密度。

另外，亦可採用1×10-4 mg/mL萘甲醇溶液測試，激發/發射特徵波長為290 nm/330 nm。

五、儀器整機性能指標的測試

5.1 動態基線噪聲與漂移

5.1.1 設備與試劑

色譜數據工作站一套，阻尼管或測試用 C18 色譜柱一支(理論塔板數不低於 18000)；

甲醇(色譜純)或純水。

5.1.2 測試方法

按照表 3 要求，設定儀器參數，連接測試系統。啟動系統，以甲醇或純水為流動相，流量為 1.0 mL/min(對 UHPLC，流量為 0.2 mL/min)，平衡穩定 60 min 後，記錄基線 60 min。然後按照 4.4.1.1 方法，計算動態基線噪聲與漂移。

5.2 梯度準確度與精密度

5.2.1 設備與試劑

色譜數據工作站一套，紫外-可見檢測器一臺，兩通一個，背壓裝置(10±2)MPa 一套。丙酮(分析純)，純水；流動相：A，純水；流動相 B，0.1%丙酮/水溶液。

5.2.2 測試方法

通過兩通和背壓裝置將梯度系統與檢測器相連，檢測器波長設置為 254 nm；色譜數據工作站與梯度系統、檢測器信號輸出端連接，按圖3設置梯度參數。恆流泵總流量設為1.0 mL/min，待儀器穩定後，開始採集數據，得到梯度曲線。測量各種溶液配比時的輸出信號值，用公式(5-1)計算各種溶液配比時的梯度誤差，取其中最大者為梯度準確度，重複三次，按照公式(5-2)計算梯度精密度。對於四元梯度系統採用同樣的方法分別測定 AB、AC、CD 、BC、BD 五組臺階梯度，每組重複三次。

5.3 系統延遲體積

設備與試劑同5.2.1。

測試方法參照5.2.2，先以100%流動相A，0.2 mL/min平衡系統,基線穩定後，按照表5設置梯度程序，啟動程序採集檢測器信號，記錄譜圖並保存。然後在譜圖上讀取基線上揚拐點(50%響應信號處)對應的時間t(min)，按照公式(5-3)計算梯度系統延遲體積。

表5 系統延遲體積梯度設置表

5.4 密封性

參照4.1.3，測試點為壓力上限90%，測試位置：(1)進樣閥後，色譜柱前；(2)色譜柱後，檢測池前。觀察恆流泵壓力降，濾紙檢測是否有洩漏。

5.5 重複性

5.5.1 設備與試劑

色譜工作站一套,帶 20uL 樣品環(對於 UHPLC，選擇 1uL 樣品環)的手動進樣閥一個(配自動進樣器則不需要)，合適規格的注射器一支(配自動進樣器則不需要)，C18 色譜柱一支(理論塔板數不低於 18000)或阻尼管；試樣參見表 6;流動相為 85%甲醇水溶液(樣品色譜峰保留因子 k 值不低於 3)或純水。

5.5.2 測試方法

儀器整機系統(包括恆流泵、檢測器、色譜柱、進樣系統、色譜工作站等)連接好，按照儀器系統配置的檢測器類型選擇流動相等測試條件和參數，見表3和表6。 以85%甲醇水溶液為流動相，流量為1.0 mL/min，基線穩定後注入20 L相應的試樣，記錄保留時間和峰面積，連續7次。

註：對於UHPLC，色譜柱選擇亞2um，2.1×50mm，流量設為0.2 mL/min，進樣量為1uL。

分別將保留時間、峰面積測試數據代入式(5-4)計算定性、定量重複性RSD值。

.................. (5-4)

式中：

RSD—定性、定量重複性相對標準偏差；

Xi—第i 次測得的保留時間或峰面積；

—n 次測量結果的算術平均值；

i—測量序號；

n—測量次數(n＝7)。

5.6 檢出限與定量限

設備與試劑同5.5.1，試樣按照表6選擇。

測試方法參照5.5.2，基線穩定後注入相應的試樣，採集譜圖，記錄色譜圖中試樣的峰高和基線噪聲，重複三次取平均值。然後按式(5-5)、(5-6)計算，作為儀器的檢出限(S/N=3)與定量限(S/N=10)。

式中：

cLOD—檢出限，mg/mL(以最小檢出濃度計)； cLOQ—定量限，mg/mL(以最小定量濃度計)；

Ni—動態基線噪聲，AU（或V）；

c—樣品濃度，mg/mL； H—樣品峰高，AU（或V）；

V—進樣體積，μL；

註：式中的數字「20」為標準的進樣體積，μL。

5.7 線性範圍

設備與試劑同5.5.1，試樣按照表6選擇。

測試方法參照5.5.2，基線穩定後，由低到高，依次注入10個不同濃度相應的試樣，採集譜圖，每個濃度重複測試三次，取算術平均值。以前五個濃度點和對應峰面積作標準曲線，計算出後五點的理論峰面積，與對應含量的峰面積比較，峰面積剛好大於計算值5%時，認為曲線彎曲，此點濃度作為線性上限CH。 以5.6測得的檢測限作為線性下限CL。最後，由CH/CL算出檢測器線性範圍。

表6 配置不同檢測器時試樣的選擇

註：仍未達到線性拐點，則需加大或減小試樣濃度後繼續進行測。