酵母發酵的小秘密——海藻糖解析

對於微尺度的世界，充滿好奇心和窺探欲的人們從未放棄過觀察。在顯微鏡發明前，人們就已經發現，保存起來用於釀酒接種的「酵母泥」在加熱後就無法使用，從而推測其是一種活物，甚至已經發明了乾酵母用於商業生產。光學顯微鏡被發明後，酵母是細胞的事實立馬被觀察到。隨著顯微鏡解析度提升，人們觀察到細胞器，進一步到生物活性分子的結構和功能，推演分子之間的相互作用。甚至現在可以通過單細胞蛋白質組學，研究一個細胞在各種條件下的蛋白質表達情況，這相當於把酵母當做單個的「人」來研究。

如此繁複的研究手段層出不窮，這恰恰說明了技術的進步，是對人們探索欲望的強烈程度最直截了當的反映。即使人類對世界已如此了解，人類的好奇心千百年來仍舊只增不減。越了解，因此越想了解，放眼人類是如此，對釀酒者來說，亦是如此。若只是止步於現有的老舊書籍，或是相互抄來抄去的結論，對我來說無法得到滿足，想必對你也一樣。因此團隊整理收集十幾年內最新研究結果，試圖從更先進的眼光去看待這個在人類文明史上存在了幾千年的古老技術過程——發酵。對我而言，這是分享，亦是學習的過程。

為什麼要說海藻糖？

可能很多釀酒師見都沒見過海藻糖這個詞，但它對酵母來說極其重要。不如說它對生物都很重要，如果當我告訴你，這種二糖其實存在並能產生於除了脊椎動物外的幾乎所有生物中時（不存在於病毒，且病毒是否是生物仍有爭議），你想必能感覺到，它會是個很重要的東西。直言不諱地說，乾酵母之所以能做成「幹的」，就是因為有海藻糖。人稍微缺點水很快就會休克甚至死亡，酵母沒水了為啥還能「活著」？在這個人人都用乾酵母的時代，理解海藻糖的作用，也是理解你手心裡那包幹酵母的第一步。

什麼是海藻糖？有啥用？

海藻糖，一種非還原二糖，是由兩個葡萄糖通過α-1,1-糖苷鍵連接而成的化合物。就化學性質而言，海藻糖比較穩定，沒有還原性，耐酸性水解，在溶液狀態下，高溫也具有穩定性，無法與蛋白質中的賴氨酸、絲氨酸殘基發生糖化反應（glycation），並且能形成分子間氫鍵。在生物上，它除了作為一種二糖來提供能量以外，還有一個十分重要的作用，就是幫助生物克服極端環境而生存下來！那酵母又是如何利用海藻糖的呢？

酵母如何利用海藻糖？

作為釀酒師，大家可能或多或少聽過，酵母在發酵過程中會面對環境壓力。在酵母面臨來自環境壓力的情況下，最明顯的特徵是發酵減緩，同時可能會產生許多不想要的發酵副產物，比如雙乙醯，硫化物等等。

發酵過程中的酵母面對的壓力有哪些？溫度過低或過高，糖度太高，酒精度太高，氧化壓力大，缺乏糖分、維生素、礦物質等營養等等。在這些不良外界壓力下，海藻糖都可以對酵母細胞進行有效保護，因此人們把酵母細胞內的海藻糖含量作為一個酵母當下所受環境壓力狀態的指標，來衡量酵母受壓情況。接下來有個有趣的研究內容，拿出來和大家分享一下。

高溫下海藻糖對細胞的保護作用：

釀過酒的朋友都知道，艾爾系列的釀酒酵母一般的活化溫度是20-40℃左右，一般認為超過40℃酵母就「死亡」了。但早在1993年，瑞士科學家Claudio DE VIRGILIO就通過實驗證明了酵母在高溫下沒那麼脆弱。這是一個什麼實驗呢？

研究者製作了一種Tps1 基因突變的釀酒酵母，這個基因是海藻糖合成酶蛋白複合體的關鍵蛋白質之一。基因突變後意味著這種釀酒酵母削弱了或者失去了海藻糖的胞內合成能力。

研究者將正常表型的釀酒酵母與Tps1 基因突變的釀酒酵母在平臺期培養三天時間，以刺激細胞合成並積累海藻糖，再將兩種酵母放置在致死溫度下（54℃下）培養20分鐘，將不同細胞的存活率製作成上圖的曲線（實心圓圈是正常表型的釀酒酵母，空心圓圈是Tps1 基因突變的釀酒酵母）。結果無法合成海藻糖的酵母在5分鐘內就大量死亡，而正常積累了海藻糖的酵母在20分鐘內的致死熱刺激下，存活率都顯著高於無法合成海藻糖的酵母。1

這個實驗雖然設計很簡單，但反應的結果很有趣：海藻糖能幫助酵母對抗環境中的熱刺激，即使這個熱溫度遠遠超過了商用乾酵母活化溫度的上限40℃，酵母也不會立刻死亡。

海藻糖保護機制理論模型：

隨著科技水平的發展，人們已經有能力深入理解海藻糖保護作用的機制原理。目前已知的理論模型有三種，分別對應不同的應用場景。

I：抗氧化保護

大家都知道酒花容易被氧化，酒花中的香氣物質主要以萜類為主，萜是一種烯烴，具有C=C雙鍵。酒花的香氣成分極易被氧化的原因，就是C=C雙鍵容易被氧化。神奇的海藻糖卻能結合在C=C雙鍵的位點，在空間上隔離了氧氣分子與C=C雙鍵的直接接觸，達到了抗氧化的作用。

以不飽和脂肪酸亞油酸為例：

一分子的海藻糖結合一個雙鍵，將雙鍵包圍起來，不給氧氣分子可趁之機。上圖展示的就是亞油酸C9, C10雙鍵及C12, C13雙鍵被上方兩個分子的海藻糖包圍的分子比例模型。

II: 玻璃化理論（Virtrification）

玻璃化指的是將液態物質轉化成非晶固體。這個理論來源於人們對於冷凍保存細胞組織的需求，大家都知道水在低於0℃時會結冰，緩慢的結冰是一個水結晶的過程，即水分子通過氫鍵形成規則排列最後形成晶體的過程，對於細胞組織來說，這些尖銳的晶體會輕易地刺破細胞膜，導致升溫後細胞內容物外流而死亡，這叫做冷凍損傷。

對人類組織是如此，對於單細胞生物酵母來說也一樣如此。研究發現，海藻糖與水分子之間的作用力遠強於水分子與水分子之間的作用力。由於海藻糖分子量較大，且能夠增加液體粘度及降低凝固點，同時和水分子間能形成穩固氫鍵，因此海藻糖可以讓水在冷卻固化的過程中不聚集形成晶體，而是圍繞在均勻分布的海藻糖周圍，形成像玻璃一樣的非晶固體，直接將當前的液體塑型，這樣細胞就被以原本的形狀保存下來，細胞也不會因為冷凍而造成損傷，冷凍僅僅是大大降低了代謝活力而已。

III：水置換理論

水置換理論指的是，海藻糖通過取代生物大分子周圍的水分子，形成海藻糖-生物大分子氫鍵，來保持生物大分子的活性結構不被破壞。

比如溶解在細胞質中的蛋白質分子，在無壓力情況下，細胞內沒有海藻糖存在，蛋白質直接與水接觸，溶解在水中的底物分子，如葡萄糖就有機會接觸到己糖激酶來進行磷酸化反應，而後被與其他蛋白酶接觸而進一步分解產生能量。

但如果酵母感受到外界壓力，在胞內產生大量海藻糖，海藻糖由於氫鍵形成能力強，取代了己糖激酶表面的水，將其封鎖起來無法接觸到水環境，也就無法接觸到葡萄糖分子，因此對葡萄糖分子的代謝也就停滯了，同時己糖激酶也被保護了起來，相當於將其與環境隔離。

類似的，細胞膜的內外表面，脂雙層的親水端周圍的水環境，也很容易被海藻糖取代，進而達到穩定結構與隔離的作用，將細胞與外界的不利環境直接隔離保護。

海藻糖的這種保護作用有多強？用我自己親歷的例子或許可以說明。有次在和小夥伴釀酒的過程中，小夥伴不慎把乾酵母丟在了接近60℃的水裡，過了一個小時發現酵母還沒活化「起泡」，我們又苦等了近兩個小時，還是什麼反應都沒有。當時小夥伴認為酵母可能全「死了」，但我們抱著試試看的心態把這鍋死「酵母」投進了發酵罐。

過了24小時，麥汁一點發酵現象都沒有，發酵罐裡一片風平浪靜，麥汁表面也沒有發酵酵母形成的泡沫。但再等了12小時左右，我們發現發酵罐裡劇烈的發酵開始了，而且根據幾天的觀察，發現降糖速度一點也不比平常正常活化的酵母差，可見最終具有發酵活力的細胞數沒有差太多，只是因為熱刺激的原因，酵母的遲滯期變得非常長，長時間處在受激後可憐巴巴的「自閉」狀態，而非死亡。受限於監測設備，我們沒法測得整個過程中溶解氧的變化，如果能測得溶解氧的變化曲線，就更能說明問題了。

有朋友就疑惑了，不是說有海藻糖才能讓酵母耐高溫嗎？商用乾酵母裡一定就有海藻糖嗎？沒錯，不光有，還很多。研究表明，酵母細胞海藻糖的含量水平是能否產生具有活性乾酵母的關鍵因素，因為海藻糖能在酵母制幹過程中提供直接保護，而海藻糖分泌不足的酵母無法被製成乾酵母。 那麼，下一個問題來了。

酵母在什麼情況下才會分泌海藻糖呢？

這其實對於好奇酵母對抗極端環境的科學家們來說，是個疑惑了他們幾十年的問題。得益於科技進步以及大家的不懈努力，酵母的海藻糖代謝模型在建立後不斷完善。到如今，大家已然能比較清晰地看待酵母的海藻糖代謝過程。

海藻糖在酵母面對壓力時產生

無壓力狀態下酵母海藻糖代謝 | Current

無壓力狀態下，TPS 複合體（Trehalose-6-phosphate Synthase Complex 海藻糖-6-磷酸合成酶複合體）不完整，導致胞內的海藻糖合成停止，且葡萄糖代謝產物G6P（葡萄糖-6-磷酸）和UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）共同抑制TPS複合體基因表達。同時，胞內的海藻糖水解酶Nth1（Neutral Trehalose Hydrolase 1）處於磷酸化激活狀態，會分解胞內任何存在的海藻糖。同時用於分解膜外海藻糖的海藻糖水解酶Ath1（Acidic Trehalose Hydrolase 1）處於液泡中，未被釋放到細胞外，處於待命狀態。

壓力狀態下，TPS複合體激活，胞內產生大量海藻糖，胞內的海藻糖水解酶Nth1被去磷酸化，因此失活而無法分解胞內大量堆積的海藻糖。α-葡糖苷轉運蛋白Agt1（α-glucoside transporter I）將胞內積累的海藻糖運至膜外，在膜外取代水分子，結合磷脂上的磷酸基團以穩定細胞膜的溫度抗性，以及提供細胞膜的隔離保護。而在這種狀況下，胞內的代謝水平下調，整體細胞準備進入休眠狀態以度過惡劣環境的難關。

壓力消失狀態下，酵母必須爭分奪秒地快速進入良好的代謝狀態，因此胞內外的海藻糖必須快速被分解。此時胞內的海藻糖水解酶Nth1被迅速磷酸化而開始分解胞內海藻糖，儲存在小液泡中的海藻糖水解酶Ath1也被轉運至膜外開始清理結合在細胞膜外的海藻糖。海藻糖被降解生成大量葡萄糖，葡萄糖代謝產生的G6P和UDPG也增多，抑制TPS複合體活性，抑制其利用胞內葡萄糖合成海藻糖。在這種調節機制下，酵母能迅速對外界環境改變做出反應，以達到快速適應的目的。

總之，酵母處於壓力環境下，海藻糖能保護細胞的活性。但另一方面，它也降低了生物反應活性。比如高溫下取代水結合蛋白質以保護蛋白質，部分蛋白質因此也喪失與底物結合的機會，導致功能性蛋白進入一種休眠狀態，這也是為什麼酵母處在壓力環境下反映出發酵遲緩的原因之一。

海藻糖的第二功能：

海藻糖還有一個作用是儲能，然而這個功能也只能算的上是主要功能的副產物，即降解後產生葡萄糖用於糖代謝。作為一種儲能物質對比糖原遠不夠優秀，不僅增加滲透壓，還會降低胞內活性，結果就是讓處在營養豐富環境下的酵母因為積累海藻糖而無法繼續吸收營養增殖，與生物繁殖目的相違背。

對於發酵的建議？

1. 乾酵母狀態下的酵母是一種什麼情形，我們為何需要活化？

乾酵母狀態下，酵母胞內外被海藻糖保護，代謝活力極其低下，因此需要一定時間活化，讓酵母吸收代謝這些海藻糖，讓生物分子恢復活性。

2. 為什麼高濃度麥汁的酵母需要活化？

因為高濃度麥汁對於酵母是一種外界壓力，乾酵母本身一方面在高滲溶液中難以吸水活化，另一方面也不願意面對壓力恢復活力，因此需要讓酵母先在舒服的環境中活化後，再加入麥汁中，防止部分酵母無法激活的情況，以至於出現發酵緩慢，代謝副產物多的情況出現。

3. 為什麼高濃度麥汁發酵逐步加糖發酵速度更快？

控制麥汁濃度，也就是控制外界不良壓力，對於健康發酵，保持酵母高生物活性有益，故而發酵速度更快。

寫在最後

如此重要的一種物質，為什麼釀酒的專業書中提及甚少？並不是因為發現晚，而是很顯然，如果只是單純釀酒，走完釀酒的流程，做好麥汁後一股腦地交給酵母去發酵而言，海藻糖的理論知識對於這樣的釀造工藝而言就可有可無。還記得最開始進入這個行業見到的一句話，「最好的釀酒師能夠釀出和自己設計一致的酒」，而無與倫比的精確控制背後除了經驗，當然還需要超越常人的理解。