4D列印用於氣管再生修復

基於光投影（DLP）的生物3D列印工藝雖然具有列印速度快、解析度高的特點，但難以成形異質細胞的複雜結構。韓國翰林大學醫學院的Chan Hum Parker課題組近期在Biomaterials期刊上發表了「4D-bioprinted silk hydrogels for tissue engineering」的文章，提出了一種新的4D生物列印策略，通過DLP技術列印載細胞的水凝膠雙層結構，利用凝膠雙層的不同形變特性來構建類氣管結構，並證明了其在體內氣管再生修復的應用。

新型4D列印技術

生物3D列印技術將含細胞的生物墨水按照預定義的列印路徑，通過層層堆積形成3D結構，在複雜組織和器官的構建方面具有巨大的優勢。目前已經廣泛應用於神經、腎臟、軟骨、骨骼、氣管、肌肉等組織工程，但仍存在組織功能性不足、列印速度慢、複雜結構列印需要支撐等挑戰。基於光投影（DLP）的生物3D列印工藝能夠直接列印高度複雜的結構，具有列印速度快、解析度高（~5μm）的優點。然而，由於逐層固化的特點，這種工藝難以實現異質細胞、複雜結構的列印。

新興的4D列印，通過在生物3D列印中引入「時間」維度，正逐漸成為下一代生物製造技術。4D列印不僅可以克服常規3D生物列印的限制，而且可以模擬天然組織發育中複雜動態過程，改善已構建組織的功能響應性。4D列印通常使用形狀記憶材料，利用滲透壓、磁場、熱、電和光等外部刺激，來驅動隨時間的結構變化。然而，4D列印往往未能考慮材料的生物相容性，且使用的外部刺激對於細胞而言過於苛刻，目前尚未有體內應用的相關研究。

因此，本研究提出了一種新的4D生物列印策略，通過DLP技術列印載細胞的水凝膠雙層結構，利用雙層凝膠的不同形變特性（濃度或結構）來構建複雜的類氣管結構，並植入受損的兔氣管模型中，以評估4D列印移植物在體內的應用。

圖1. SF-MA凝膠雙層結構的4D列印和變形機制

構建策略

SF-MA生物墨水的製備

通過絲素蛋白（silk fibroin, SF）與丙烯酸縮水酯（glycidyl methacrylate, MA）的合成反應，得到可光聚合的SF-MA材料；將30wt%的SF-MA材料和0.2%的LAP光引發劑（Lithium phenyl phosphinate, 365nm）溶解於培養基溶液中，同時加入130mM氯化鈉溶液來調整滲透壓；將人軟骨細胞和鼻甲骨來源的間充質幹細胞(TBSCs)分別與SF-MA溶液混合，配製成細胞密度為1×107/mL的生物墨水。

「氣管」結構的4D列印

採用投影式光固化印表機列印雙層（載細胞）水凝膠，每層厚度50μm，光照強度為3.5mW cm−2。其中，TBSCs間充質幹細胞分布在基質層（base layer），厚度為3層，每層光固化時間為5秒；而軟骨細胞則分布在上面的圖案層（pattern layer），層厚為7層，每層光固化時間為4.5秒。列印後，用PBS溶液清洗3次，以去除未粘附的細胞和材料。列印的雙層水凝膠結構在培養液中通過進一步的變形，得到「氣管」結構，並在體外繼續培養兩周。

類氣管的體內移植與評價

採用紐西蘭兔作為模型動物（共12隻），麻醉後通過頸部正中切開皮膚，用手術刀在氣管前壁切開1釐米長的環狀氣管，構建兔氣管損傷模型。將4D列印的類氣管結構植入到受損部位，將分離的帶狀肌移位至種植體上方並縫合，每日腹腔注射環孢素A進行免疫抑制，在術後1、2、4、6和8周使用內窺鏡觀察獲得氣管內圖像。

圖2. 類氣管結構的4D列印和體內移植

實驗結果與分析

4D列印的類氣管結構和生物學評價

3D列印的凝膠雙層結構在培養液中逐漸變形成類氣管結構，並可以維持兩周以上（圖3.b）。相比於20°C時，在37°C的環境溫度可以提高凝膠雙層結構的變形速率，並產生更硬的水凝膠結構。通過免疫組化染色，檢測到紅色標記的人軟骨細胞主要分布在圖案層，不受形變的影響，並分泌形成軟骨特有的細胞外基質（圖3.c）。

圖3.SF-MA凝膠雙層結構變形為類氣管

類氣管的體內移植與評價

如圖4.b所示，內窺鏡觀察顯示人造氣管與周圍宿主氣管之間的縫合完整，沒有破裂；術後4周時，仍觀察到暴露的人造氣管；術後6周時人造氣管表面覆蓋有上皮黏膜，同時觀察到光狹窄（light stenosis）；術後8周時，光狹窄穩定存在，且氣道仍是開放的。如圖4.c-d所示，在組織病理學分析中，觀察到植入的人造氣管與周圍氣管穩定結合，從切口部位沿氣管壁形成無序的呼吸上皮黏膜（第2周），並逐漸重構形成緊密排列的假復層纖毛柱狀上皮（第8周），與正常氣管相當。如圖4.e所示，在人造氣管內部和缺損邊緣觀察到新形成的未成熟軟骨（粉紅色），周圍為軟骨膜包裹（綠色），並在第8周時觀察到明顯的透明軟骨特徵，表示軟骨組織在逐級成熟。

圖4.類氣管的體內移植和組織學評價

總結

本研究提出了一種具有良好細胞相容性的4D生物列印策略，通過DLP技術列印載細胞的多層水凝膠結構，利用不同層凝膠的濃度和結構差異產生的形變特性，變形重構形成類氣管結構，並通過兔氣管缺損模型驗證了4D生物列印在氣管再生修復的應用。

參考文獻

Kim, S.H., et al., 4D-bioprintedsilk hydrogels for tissue engineering. Biomaterials, 2020. 260: p. 120281.(https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120281)