慢病毒載體滴度的檢測方法

2021-01-19 每日生物評論


慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒源於反轉錄病毒，但又有所不同。在感染能力方面比反轉錄病毒還強，又很少引發基因的免疫反應。在基因治療中廣泛應用的逆轉錄病毒載體存在的主要問題，是無法高效轉導非分裂期細胞。慢病毒載體不但可以感染非分裂期細胞，還具有容納外源性目的基因片段大、穩定整合持久表達、免疫反應小等優點。慢病毒載體的研究發展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、幹細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。慢病毒相關產品和技術服務越來越受到科研工作者的青睞，而慢病毒滴度是衡量慢病毒相關產品和技術服務的重要指標。






病毒的滴度即每升溶液中含有的病毒數量。滴度值用於評估轉導一定數量靶細胞所需要的病毒數量。轉導單位(TU)即能夠感染並整合到細胞內的病毒載體基因組。常規生產的病毒的滴度在2 x 10E8TU/ml之間。


下面我們就來聊下幾種常見的慢病毒載體滴度的檢測方法。傳統的慢病毒包裝效率檢測方法有ELISA法（檢測P24蛋白）和Real-time PCR法（檢測核酸拷貝數），最近又有了基於膠體金層析技術的半定量檢測卡。我們一一介紹。





當通過純化獲得重組慢病毒顆粒後，需要對慢病毒液的濃度或感染活性進行定量檢測。一般來說，對於病毒顆粒進行定量主要是通過檢測純化的病毒液中DNA的OD260來檢測其病毒含量（Quantitation）；而對於病毒顆粒的滴度檢測（Titer），則需要通過傳統的克隆成斑試驗或者對病毒特異蛋白的免疫反應試驗等檢測，如：慢病毒外殼蛋白p24的免疫學ELISA方案。p24蛋白是慢病毒外殼中含量最大的標誌性蛋白。基於慢病毒p24蛋白的ELISA分析分兩種，一種稱為傳統的p24蛋白ELISA檢測（Quantitation Kit (Traditional HIV p24 ELISA)），能檢測所有p24蛋白，從而實現對病毒滴度的定量。分為一次96孔板分析和五次96孔板分析，採用ELISA方法，反應靈敏，可檢測1 ng/mL HIV p24蛋白，最後分光光度計讀取數據。由於病毒顆粒的外殼蛋白p24蛋白是由包裝細胞系提供的，因此在使用檢測的時候不可避免的會將病毒顆粒本身的p24蛋白與包裝細胞系產生的p24蛋白一起檢測，造成實驗的誤差，而較新的Lentivirus Titer Kit(Lentivirus-Associated HIV p24)能分離出包裝細胞產生的游離p24蛋白，只檢測病毒顆粒表面的p24，因此實驗數據更真實準確。分為一次96孔板分析和五次96孔板分析，採用ELISA方法，反應靈敏，可檢測1 ng /mL HIV p24蛋白，最後分光光度計讀取數據。





慢病毒感染靶細胞的感染效率可以通過Real-time PCR檢測靶細胞中的慢病毒載體拷貝數來測算。所謂Real-Time PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用螢光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。real-time PCR技術即實時螢光定量PCR避免了傳統PCR以終產物監測定量產生的偏差，提高實驗的重複性。該技術已經被廣泛用於監測細胞mRNA表達量的變化;比較不同組織的mRNA表達差異;驗證基因晶片，siRNA幹擾的實驗結果。





基於膠體金層析技術的慢病毒載體滴度半定量快速檢測卡可用於慢病毒載體和假病毒包裝效率的快速評估。僅需1滴培養液，10-15min即可獲得結果。 膠體金檢測卡的檢測下限可到達1ng/mL，當樣品中P24濃度在1ng/mL至500ng/mL時，檢測線顏色的深淺與P24濃度呈正相關，通過比色卡比較，可以半定量待檢樣品中P24濃度，並大致估算慢病毒滴度。


判定病毒包裝是否成功；

初步判定病毒包裝滴度，為是否繼續培養或收毒提供判斷依據；

為反覆收毒提供判斷依據，每次達到固定顏色時收毒。




檢測卡顯色樣式



比色卡


一個慢病毒顆粒（Lentiviral Particle, LP）中約有2000個P24蛋白分子，用以下公式可以計算慢病毒載體的顆粒數（LP）：


一個LP相當於：2000×24×10^3/(6×10^23)g of P24=8×10^-5 pg of P24；或者說，1ng P24=1.25×10^7 LPs（≈1.25×10^4-5 TU**）


正常情況下，每100-1000 LPs中會有1個具有感染活性的病毒載體，即1 TU（Transducing Unit）。


注意：上述公式計算得到的LP值是理論值，檢測樣品中含有的游離的P24蛋白可能會使該值偏高。


提示：通常上清中病毒含量需要超過10^6 TU/ml，才能確保濃縮純化後得到足夠濃度的慢病毒載體（一般能濃縮150倍左右）。





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