武漢同濟醫院檢驗科實戰經驗:新冠病毒檢測常見問題處理

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科

新型冠狀病毒流行地區

臨床實驗室常見問題解答

(第一版)

　　1. 分子生物學實驗室的生物安全和個人防護要求如何?

　　生物安全二級及以上實驗室條件和生物安全三級實驗室級別的個人防護，如一次性醫用防護服、護目鏡、雙層手套、醫用防護口罩(如3M公司的1860/9132醫用N95口罩，口罩必須做氣密性檢測)、防護靴套。口罩等防護用品的佩戴一定要正確，否則等同於無防護。三級防護的個人需保證休整時間，連續工作4個小時以上會因缺氧而導致乏力、頭暈等不良反應。需正確識別高強度工作狀態下的身體不適與病毒感染引起的早期症狀的區別，避免產生不必要的心理壓力。

　　2. 發熱門診的血液、大小便樣本的處理和檢測如何開展?

　　是否需要單獨開闢獨立的空間和設施?

　　中東呼吸症候群冠狀病毒(MERS)可在呼吸道樣本、血液和糞便樣本中檢出，同科屬的新型冠狀病毒(2019-nCoV)潛在具有上述特性。目前的資料表明：經呼吸道飛沫傳播是2019-nCoV的主要傳播途徑，亦可通過接觸傳播(如手-口途徑、糞-口途徑)。因此來自2019-nCoV感染病人的非呼吸道樣本也具有潛在的感染性，應儘量避免暴露環節(如不開蓋的血常規檢測模式)以及避免產生氣溶膠(離心後靜置)。不可避免的暴露性操作(如開蓋等)應在生物安全櫃中進行。由於感染者和非感染者難以區分，應將所有樣本視為具有感染性(標準預防)，在條件不允許的情況下可不設立獨立的檢測空間，但工作人員必須佩戴外科口罩或醫用防護口罩等個人防護措施，並保證環境的生物安全。對疑似病人樣本給予更高的重視，對處理後樣本、廢棄物及環境執行更嚴格、頻繁的消毒滅菌措施(見下述第6條)。

　　3. 樣本的轉運流程?

　　可依據「國衛辦醫函【2020】53號」文件執行。

　　院內運輸：樣本由醫護人員採集後，放入兩層一次性密封袋內密封，置於樣本轉運箱後，與樣本運送人員交接，樣本由專人運送入實驗室。樣本運送過程中，運送人員應佩戴帽子、一次性外科口罩、手套、隔離衣。

　　院外運輸：按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規定》(衛生部令第45號)要求執行。

　　4. 病毒滅活處理方法?

　　文獻及指南報導，56℃ 30 min可滅活冠狀病毒，我們的初步試驗表明，幹浴(烤箱或恆溫箱)56℃ 30min或50℃ 60min的滅活方式不影響呼吸道樣本中RNA病毒的檢測(見圖1)。時間所限，我們對於此次新冠病毒的評估尚未完成，將在再版中更新這一內容。

圖1 不同滅活方式對PCR檢測結果的影響

　　根據上述結果，並綜合其它資料，為了減少感染樣本對人和環境的潛在危害，我們初步推薦：呼吸道樣本(微生物等培養目的除外)先56℃幹浴 60 min，靜置10 min至室溫(避免氣溶膠)，然後進行處理。

　　但必須強調的是，病毒滅活效果與其所在基質成分有關，因實驗條件所限，我們無法評估該方法滅活病毒的真實效果。此外，我們選擇幹浴後靜置10 min是基於我們現有的樣本量及實驗條件。理論上，幹浴後靜置的時間越長，產生氣溶膠的風險越小。基於此，幹浴處理後的樣本仍視為具有感染性，其後續處理應視同未滅活的樣本。

　　5. 廢棄物如何處理?

　　對檢測完成後的疑似病人樣本採用雙層塑膠袋密封;對實驗過程中產生的廢液和槍頭等置於含0.5%～1%有效氯的含氯消毒液的廢液缸。上述物品經壓力蒸汽滅菌處理。詳見《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》(第三版)。

　　6. 檢驗科如何合理設置呼吸道樣本檢測項目組合?

　　依據方便(臨床採樣和檢驗科檢測)和安全原則對項目組合進行安排。2019-nCoV核酸檢測項目宜單獨申請，單獨採樣，方便檢測。其它呼吸道病毒核酸檢測項目(流感、腺病毒、呼吸道合胞病毒等)則可單獨和/或組合申請。所有呼吸道樣本均應視為潛在的感染源，並做相應處理和防護。更重要的是建立一套完善的有關2019-nCoV檢測的管理機制，涵蓋項目申請、檢測時限、報告時間、報告方式、對內對外聯繫，以及分析前、中、後各種環節。

　　7. 生物安全櫃的選擇和使用注意事項?

　　對潛在含有2019-nCoV的呼吸道樣本的操作應在生物安全櫃(biosafety cabinet)中進行，工作狀態下遵守操作規程可保證工作人員不受侵害。生物安全櫃檢定合格方能使用(包括外觀和功能、潔淨度等級、垂直氣流平均風速、工作窗口進風平均風速、照度、噪音、氣流狀態)。

　　操作注意事項：

　　⑴風機運行至少5min後方可開始操作;

　　⑵櫃內儘量少放物品，以免影響氣流循環;

　　⑶避免幹擾氣流，不良行為包括手臂頻繁出入，操作者身後人員頻繁走動，阻擋空氣格柵;

　　⑷在中後部操作，並不影響透過玻璃擋板觀察;

　　⑸櫃內不可進行文字工作;

　　⑹風機運行至少5 min後方可關機;

　　⑺工作完成後、每天下班前，使用適當消毒劑擦拭表面。

　　8. 在防護用品不能完全達到要求的時候，怎樣最大程度地自我保護及進行實驗室安全防護?

　　無論防護條件是否滿足要求，標準預防、不定期通風和手衛生是最重要的防護措施。

　　此外，必須牢記三個防控要素。

　　⑴人員：必須有安全意識，不能麻痺大意，以往及當下的經驗教訓表明安全意識越強，感染的機率越小。

　　具體措施：

　　①無論是否處於工作狀態，無論是否在病房或是其它環境，佩戴口罩，不到萬不得已的情況，比如吃飯、喝水，都不要摘下，如果需要摘下口罩，強烈建議先進行手消毒再摘下口罩;

　　②醫務人員儘量避免集體就餐，最好是分次就餐，減少小範圍群體性暴露;

　　③直接面對病人的窗口工作人員和接觸呼吸道樣本的相關人員必須嚴格執行生物安全三級實驗室級別的個人防護。

　　⑵操作：必須視所有樣本為潛在感染源，實行標準預防措施。對高危的呼吸道樣本(檢測核酸或抗原)在送達實驗室之前滅活(見上述方法和圖1)，可最大程度減少生物危害。處理呼吸道樣本必須在生物安全櫃中進行，操作過程輕柔避免飛濺。實驗過程中產生的汙物必須高壓滅菌後才能運出實驗室。

　　⑶環境：桌面、儀器、固定設施及地面至少每日採用0.5%～1%含氯消毒液擦拭。含氯消毒液(注意，洗必泰[氯己定]不能有效滅活病毒)、75%的酒精等消毒物品應隨手可及，便於隨時消毒。PCR實驗結束後應紫外照射房間及相關設施以消除核酸汙染，同時殺滅病毒。紫外消毒時必須保證門窗緊閉。

　　9. 樣本類型?採集流程和容器?

　　呼吸道樣本(包括咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物、痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等)均可。為了減少汙染流程可相對固定一種樣本類型及操作簡便的方法，以便更好實施(除特殊情況下需採集特定的樣本)。對自動核酸提取方法而言，採用帶病毒保存液的咽拭子或鼻咽拭子可避免開蓋添加生理鹽水的步驟。採樣人員必須嚴格執行生物安全三級實驗室級別的個人防護。樣本採集質量嚴重影響檢測結果，需對採樣人員進行專業培訓，如咽拭子採集應擦拭兩側顎弓和咽、扁桃體的分泌物。

　　10. 核酸提取方法、試劑的選擇?

　　目前RNA提取方法眾多，實驗室應選擇簡便、高效的核酸提取方法。我們當前使用的蛋白酶K消化，磁珠分離的全自動核酸提取方法證明有效。由於2019-nCoV感染是突發事件，各種試劑通過快審進入臨床最大程度解決了臨床急需，但當前存在以下兩方面的問題給結果的報告和解釋造成了較大的困擾。

　　⑴不同試劑盒陽性檢出率存在較大差別;

　　⑵一部分試劑盒檢測ORF1ab和E及N基因，另一部分試劑盒只檢測ORF1ab和N基因，部分試劑的單陽性結果佔陽性結果的20%以上。

　　另一個值得關注的問題是試劑的選擇還需與實驗室的硬體設備相匹配，如有的儀器對PCR擴增管有特別要求(100μL或者200μL)等。

　　11. 報告模板?

　　基於上述問題，我們建議以陽性、可疑和陰性三種結果進行報告，對單陽性的結果及可疑結果建議採用不同試劑盒進行覆核，並進行備註(圖2)。部分地區可將陽性和可疑的樣本送CDC確證。

圖2 同濟檢驗科2019-nCoV核酸檢測報告模板

　　參考文獻：

　　1. 國家衛生健康委辦公廳關於醫療機構開展新型冠狀病毒核酸檢測有關要求的通知.國衛辦醫函【2020】53號

　　2. 關於印發新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第四版)的通知. 國衛辦醫函【2020】77號

　　3. 新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第三版)

　　4. Real-Time RT-PCR Panel for Detection 2019-Novel Coronavirus.

　　https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html

　　5.https://mp.weixin.qq.com/s/uWiOOpfxQH4c77rAFXfNgQ