如何利用基因魔剪—CRISPR技術來進行非編碼基因組功能的研究?
2020-12-01 生物谷
2016年10月22日 訊 /生物谷BIOON/ --我們或許才剛剛開始打開對巨大的基因組非編碼區域的研究，基於CRISPR的兩項新技術或許就能夠幫我們開啟研究的新篇章。我們(原文筆者)能夠很好地理解基因組中編碼蛋白組分背後的規則，同時通過對DNA序列的觀察我們也能夠找出從事編碼作用的基因的開始以及終止位置。
對於基因組中殘留的98%的基因組而言，卻又是一番不同的故事了，如今我們對於DNA暗物質的理解都是來自於對非編碼DNA單個片段的研究和理解，而真正指導非編碼基因組發揮作用的規則目前研究者並不清楚。博德研究所的創始主任Eric Lander說道，90%的影響人類疾病的遺傳突變都位於非編碼區域，但如今我們並沒有有效的方法去闡明到底是哪些調節子在影響著這些基因的表達
刊登在Science雜誌上的一篇研究報告中，來自博德研究所的兩個研究團隊通過研究利用CRISPR基因編輯技術揭示了非編碼基因工作的機制。利用兩種互補的方法，研究人員以CRISPR作為工具系統性地同時調查了數千個非編碼的DNA序列，研究人員（來自Lander實驗室和來自Zhang Feng實驗室的研究者）在研究中鑑別出了多個非常有意思的遺傳調節子，其中就包括那些遠離所控制基因位點的數以百萬計的鹼基。
研究者Jesse Engreitz指出，我們希望能夠在每個細胞周期中對控制每個基因表達的非編碼元件進行編錄，這在生物學研究上是一個非常大的問題，而且這也是一個限速的步驟，即將和基礎分子機制相關的許多遺傳特性同人類疾病相聯繫。
變化多端
目前兩個研究小組都利用了CRISPR進行了相關篩查來幹擾非編碼的DNA，但兩個研究小組卻是利用不同的方法來進行了相關研究。研究者張峰(Zhang Feng)利用Cas9來對非編碼DNA的重疊延伸片段進行精準的切割，在這種情況下，圍繞在三個基因NF1， NF2和CUL3周圍區域的功能就會喪失，而這與某些形式的黑色素瘤耐藥性產生直接相關。研究者解釋道，這種方法就能夠幫助我們誘導一系列多樣性突變的產生，而且我們也不必推測既定的序列為何會被幹擾。
另外一組研究者Engreitz等人則利用了CRISPR的幹擾系統，即利用失活形式的Cas9同KRAB蛋白相互融合從而沉默靶向序列的表達，這些靶向序列圍繞在MYC和GATA1附近，這兩個基因是重要的轉錄因子。Engreitz說道，這種系統能夠幫助我們隊非編碼區域的調節性影響進行定量的評估，同時其還能夠為我們展示如何能夠控制一個既定的基因。
每個研究小組都利用了一種功能性的「讀數器」以及深度的測序技術觀察了哪種導向RNAs能夠影響目標基因的表達，同時還能夠幫助繪製出導向RNAs所影響的調節子的圖譜。兩個研究團隊的研究結果都闡明了利用CRISPR工具追蹤非編碼基因組調節機制的重要性。研究者Engreitz等人闡明了7個MYC和3個GATA1增強子的重要性，而張峰研究團隊則篩選出了多個增強子以及僅結合CUL3的轉錄因子結合位點。
在「自然棲息地」對序列進行研究
類似於傳統的報導分子實驗，即科學家們感興趣的在質粒中將序列同報導自偶聯進行研究；這些混合的CRISPR篩選技術有著明顯的不同，其能夠直接探查序列，也就是說在最原始的位點進行序列的研究解讀。研究者Sanjana強調道，這些篩選技術能夠從內源性的角度來對序列進行研究，同時報導子實驗也是非常有幫助的，但其缺少了3D構象和局部的染色質環境，在這裡這些調節性序列或許就會經歷正常的一些相互作用。
研究者表示，舉個例子說，我們或許能夠在基因啟動子和非編碼位點之間觀察到長期的循環結構，但如果我們僅僅觀察這些調節性原件的話或許就會錯過一些感興趣的3D相互作用。Engreitz指出，目前存在一種限制，不管是CRISPR方法還是別的方法，在當前的形式下，發現基因組固有的冗餘程度或許並不足以破碎一種增強子來理解基因被控制機制，或許我們需要對多個增強子進行打斷來研究。
但Engreitz及其同事表示非常樂觀，他們希望能夠利用基於CRISPR的技術來闡明非編碼基因組背後所隱藏的秘密。目前在非編碼基因組上研究的最大挑戰就是，儘管非編碼基因組非常龐大，但其中所包含的單一功能性元件卻是非常小的，未來研究者希望開發新的研究方法在保證非編碼基因組較高解析度的情況下對更大的基因組區域進行探索。
研究者指出，隨著他們繪製出多個圖譜以及其相關性，他們相信能夠幫助預測關於非編碼基因組的一些信息；利用導向RNAs文庫引入CRISPR或者抑制子或許就能夠幫助研究者闡明大塊區域的非編碼DNA對不同基因的作用以及效應，而屆時科學家們或許才剛剛打開對基因調節的系統性圖譜研究的第一步。（生物谷Bioon.com）
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參考資料：
【1】Reading the rules of gene regulation with CRISPR
【2】High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome
Science DOI： 10.1126/science.aaf7613
【3】Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference
Science DOI： 10.1126/science.aag2445
【4】A massive approach to finding what's "real" in genome-wide association data
【5】CRISPR system scales up in human cells
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