CCS Chemistry | DNA去甲基化新通路:5-羧基胞嘧啶直接脫羧基

2020-12-05 澎湃新聞

以下文章來源於CCSChemistry ，作者CCS Chemistry

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武漢大學袁必鋒-馮鈺錡課題組通過設計合成含有5-羧基胞嘧啶（5caC）的DNA，結合穩定同位素標記和質譜分析技術，發現DNA中的5caC 可以通過碳碳鍵的斷裂直接脫羧基生成胞嘧啶，從而構成DNA中5-甲基胞嘧啶（5mC）去甲基化的新通路。

DNA的甲基化調節基因的表達和沉默,與癌症和老年痴呆等許多疾病密切相關。但是，為了保證基因在適當的發育階段進行程序性表達，生物體內也會發生DNA去甲基化(demethylation)的現象來調節DNA甲基化程度。DNA甲基化和去甲基化的動態平衡控制著生物體內基因表達的強度。

DNA去甲基化是指5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)被胞嘧啶取代。近年來研究發現動物中去甲基化的一個主要機制是：TET（ten-eleven translocation）蛋白先將5mC氧化生成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），隨後通過TDG糖苷酶（thymine DNA glycosylase）識別並切割5fC和5caC的糖苷鍵，形成無鹼基的AP位點，進而通過鹼基切除修復（base excision repair，BER）得到未甲基化的胞嘧啶。

TDG-BER是目前哺乳動物基因組DNA中5mC去甲基化的主要機制，但並不適用於所有情形。有研究發現TDG基因敲除掉的小鼠受精卵中5mC的去甲基化過程並沒有受到影響（Cell Stem Cell. 2014, 15, 447-458），暗示5mC的去甲基化可能存在著一種不依賴於TDG糖苷酶的機制。此外，在TDG糖苷酶切除5fC和5caC糖苷鍵的過程以及在BER修復過程中會產生DNA鏈的斷裂等中間體，因此基於TET -BER機制的DNA去甲基化會危害基因組的穩定性和完整性。

武漢大學袁必鋒-馮鈺錡課題組設計合成了一條含有5caC修飾並含有酶切位點的發卡DNA（5caC-DNA），5caC-DNA鏈的3』末端標記生物素Biotin，5caC-DNA鏈上7個位置的磷酸二酯鍵中的氧原子用硫原子進行替換。首先將5caC-DNA與細胞裂解物進行溫育，用鏈黴親和素磁珠富集溫育後的DNA。富集的DNA酶解為核苷酸或者寡核苷酸鏈後進行質譜分析，發現了5caC直接脫羧產物：硫代胞嘧啶單磷酸核苷酸（S-dCMP），以及5caC直接脫羧基產生的寡核苷酸鏈（[M-4H]4-, m/z 1859.67），證實細胞提取物可以使5caC直接脫羧基。

作者進一步將5caC-DNA轉染進入細胞，並在轉染後不同時間點收穫細胞。通過分析由體內富集出的DNA酶解的核苷酸或者寡核苷酸鏈，發現了5caC直接脫羧產物：S-dCMP，以及脫羧基寡核苷酸鏈（[M-4H]4-, m/z 1859.67），證實5caC在體內可以發生直接脫羧基（圖一）。

圖一. 5caC內源性脫羧基。(a) 5caC內源性脫羧基實驗流程圖。(b) 質譜分析5caC核苷酸底物S-cadCMP。(c) 質譜分析5caC直接脫羧基核苷酸產物S-dCMP。(c) 質譜分析5caC直接脫羧基後重新甲基化的核苷酸產物S-5mdCMP。

由於細胞內存在TGD-BER通路，因此轉入到細胞中的5caC-DNA也會由此通路修復為未修飾的胞嘧啶。通過酶切產生的寡核苷酸鏈分析可以觀察到底物寡核苷酸鏈（[M-4H]4-, m/z 1870.67），直接脫羧基產生的寡核苷酸鏈（[M-4H]4-, m/z 1859.67），以及短修復產生的寡核苷酸鏈（[M-4H]4-, m/z 1855.68）和長修復產生的寡核苷酸鏈（[M-4H]4-, m/z 1851.68）（圖二）。定量分析發現5caC的體內直接脫羧基、以及經過TDG-BER通路（短修復和長修復）的比例約為1/3和2/3（圖二）。

圖二. 質譜分析寡核苷酸證實不同時間點5caC內源性脫羧基以及比例。

m/z 1870.67：底物寡核苷酸鏈；m/z 1859.67：直接脫羧基產生的寡核苷酸鏈；m/z 1855.68：短修復產生的寡核苷酸鏈；m/z 1851.68：長修復產生的寡核苷酸鏈。

接下來作者使用TDG糖苷酶抑制劑抑制TDG活性，以及通過siRNA敲低TDG基因、或者通過CRISPER-Cas9 敲除TDG基因，使TDG蛋白表達降低或喪失。結果發現在TDG糖苷酶活性抑制或喪失的細胞中，5caC直接脫羧基的比例增加，而TDG-BER通路比例減少，進一步證實體內存在基於5caC直接脫羧基和基於TDG-BER通路的兩種DNA去甲基化機制。

隨後作者通過穩定同位素代謝標記，將細胞基因組中的dC替換為15N3-dC，然後將5caC-DNA轉染進入細胞。實驗結果也同樣發現了直接脫羧基產物S-dCMP和TDG-BER通路進行修復的產物15N3標記的胞嘧啶單磷酸核苷酸（15N3-dCMP）。通過分析酶切產生的寡核苷酸鏈，進一步證實5caC直接脫羧基與TDG-BER通路所佔的比例分別約為1/3和2/3。

該研究工作提出的基於5caC直接脫羧基的DNA去甲基化新機制只涉及到TET蛋白氧化5mC生成5caC後的一步脫羧基反應，因此該5mC去甲基化新機制不涉及DNA鏈的斷裂、節省細胞物質和能量。研究工作對深入認識DNA表觀遺傳修飾的調控機制有積極意義。北京大學伊成器教授和武漢大學周翔教授對本項工作提供了幫助和支持。研究得到了國家自然科學基金的資助。該工作以Research Article 的形式發表在CCS Chemistry，已在官網「Just Published」欄目上線。

文章詳情：

Transformation of 5-Carboxylcytosine to Cytosine Through C–C Bond Cleavage in Human Cells Constitutes a Novel Pathway for DNA Demethylation

Yang Feng, Neng-Bin Xie, Wan-Bing Tao, Jiang-Hui Ding, Xue-Jiao You, Cheng-Jie Ma, Xiaoxue Zhang, Chengqi Yi, Xiang Zhou, Bi-Feng Yuan* & Yu-Qi Feng

Citation: CCS Chem. 2020, 2, 994-1008

文章連結：https://doi.org/10.31635/ccschem.020.202000286

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