甲基化DNA IP(MeDIP)抗體大比拼

2021-01-10 CST中國

CST 5-甲基（5-mC）和 5-甲醯基胞嘧啶（5-fC）兔單克隆抗體表現出強大的特異性

在DNA胞嘧啶（cytosine）殘基的甲基化會造成基因沉默，通常由一些DNA甲基轉移酶介導產生。TET（Ten-ElevenTranslocation）家族蛋白催化5-甲基胞嘧啶（5-mC）的氧化，進而形成5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），這種DNA修飾反而會促進基因的激活。TET家族蛋白可進一步將5-hmC氧化為5-甲醯基胞嘧啶（5-fC）和5-羧基胞嘧啶（5-cac）兩種修飾，並促進TDG糖苷酶和鹼基切除修復（BER）通路介導的胞嘧啶主動去甲基化過程。

我們利用ELISA或甲基化DNA免疫沉澱（MeDIP）測定了CST生產的5-Methylcytosine (5-mC) (克隆號D3S2Z)兔單抗#28692和5-Formylcytosine (5-fC) (克隆號D5D4K)兔單抗#74178的特異性，並與其他公司生產的相應抗體進行了比較。

使用ELISA方法進行抗體特異性比較

針對含有單個未經修飾的胞嘧啶或不同修飾的胞嘧啶（即5-mC、5-hmc、5-cac和5-fC）的不同單鏈DNA寡核苷酸，分別進行抗體滴定法測試，結果如下：

上圖顯示，CST5-mC兔單克隆抗體（左圖）與含甲基化胞嘧啶的寡核苷酸具有高度特異性，顯示與含有其他類型胞嘧啶修飾的寡核苷酸的結合可以忽略不計，而來自其它公司的5-mC鼠單抗（克隆號33d3；右圖）顯示與含有其他類型修飾胞嘧啶的寡核苷酸有交叉反應。其中，最突出的交叉反應是發生在含有5-fC和5-hmc的寡核苷酸，而含有5-cac的寡核苷酸次之。此外，克隆33d3也表現出與未甲基化DNA相當大的交叉反應性。

如上圖所示，CST生產的5-fC兔單克隆抗體（左）與含有甲醯基胞嘧啶的寡核苷酸特異性結合，而另一家公司生產的一個5-fC多克隆抗體（右）表現出與5-hmc明顯的交叉反應性，以及與其他甲基化類型較小程度的交叉反應性。

使用DNA IP方法進行特異性比較

我們接著對5-Methylcytosine (5-mC) (克隆號D3S2Z)兔單抗#28692和33D3抗體進行了DNA IP性能的比較。從小鼠胚胎幹細胞製備基因組DNA並添加含有非甲基化胞嘧啶、或5-mC、或5-hmc的對照DNA作為樣本分別進行DNA IP。DNA IP過程分別採用兔單抗#28692、克隆33D3和SimpleDIP Methylated DNA IP (MeDIP)試劑盒# 76853。利用特異性針對不同對照DNA序列的引物，通過實時定量PCR技術對擴增片段進行定量分析。每個樣本中免疫沉澱獲得的DNA量，表示為佔輸入DNA總量的百分比。

如上圖清楚顯示，CST5-mC兔單克隆抗體#28692顯示出與含5-mC的DNA高度特異性結合，而與含5-hmC的DNA沒有結合。相反，來自其它公司的克隆33d3竟然顯示與含5-hmC的DNA的交叉反應，而與含5-mC的DNA結合反應程度一般，說明該抗體的特異性不佳，會造成結果判讀出現誤差。

總之，CST提供針對多種胞嘧啶修飾DNA的兔單克隆抗體：

經多項內部質量檢測，可高度特異性識別不同胞嘧啶修飾類型的DNA。

CST的兔單克隆抗體，具有高度的批次間一致性和重複性。

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