江南大學實現基於丙酮酸響應基因迴路的中心代謝動態調控

近日，Nature Chemical Biology 期刊在線發表了江南大學生物工程學院生物系統與生物加工工程研究室陳堅院士團隊劉龍教授課題組的最新研究成果：Pyruvate-responsive genetic circuits for dynamic control of central metabolism。

如何實現微生物中心代謝網絡代謝流的最優分配是構建微生物底盤細胞的關鍵。基因迴路目前被廣泛應用於代謝網絡的動態控制，其可以有效避免有毒中間代謝物的積累，平衡細胞生長與產物合成的代謝流，從而提高產物的合成效率。這些基因迴路大多通過響應外界環境信號、中間代謝物和信號分子發揮功能。然而，目前缺乏能夠響應胞內關鍵中心代謝物的基因迴路，例如丙酮酸。

丙酮酸是連接細胞糖酵解途徑與三羧酸循環的關鍵中心代謝物，其一方面為產物的合成提供碳骨架，另一方面進入三羧酸循環為細胞生長提供能量與還原力。因此，構建響應胞內丙酮酸濃度的基因迴路能夠實現碳中心代謝流的動態控制，進而促進中心代謝衍生產物的高效合成。

本研究首先基於大腸桿菌來源的丙酮酸響應轉錄因子PdhR，在枯草芽孢桿菌（B. subtilis）中設計、構建了丙酮酸響應基因迴路，進一步通過突變以及改變PdhR在啟動子上的結合序列與位置，優化了丙酮酸響應基因迴路的動態範圍，隨後測試了所構建基因迴路的正交性和響應閾值。

基於PdhR的丙酮酸響應基因迴路的構建和特性

然而，獲得的基因迴路都為丙酮酸激活型的迴路，為構建丙酮酸抑制型的基因迴路，需要在基因迴路中引入「非」門，實現正負信號的轉換。反義轉錄是生物界中普遍存在的基因表達調控方式，其通過形成反義RNA以及轉錄幹擾影響正義鏈編碼基因的表達。相對目前常用的sRNA和CRISPRi調控系統，反義轉錄並不需要在細胞中引入異源的調控蛋白且能夠同時發揮順式與反式的調控功能，因此具有更好的潛在應用前景。

作者首先驗證了反義轉錄在枯草芽孢桿菌中的功能，並結合實驗數據以及模型預測，發現轉錄幹擾是反義轉錄發揮功能的主要機制，並揭示活性越強的啟動子越容易因為「自閉塞效應」而受到轉錄幹擾的影響。此結果意味著反義轉錄的調控元件不需要在質粒上進行表達，就能夠通過順式作用的方式有效的調控目的基因的表達。隨後，作者結合反義轉錄以及高通量篩選技術，成功獲得丙酮酸抑制型的基因迴路。從而獲得受胞內丙酮酸誘導的雙功能基因迴路。

枯草芽孢桿菌中反義轉錄調控作用的功能測試

利用反義轉錄構建丙酮酸抑制型基因迴路

最後，作者利用雙功能的丙酮酸生物傳感器設計反饋控制系統，該系統使細胞能夠自發地響應胞內丙酮酸濃度，動態優化枯草芽孢桿菌中心碳代謝途徑的代謝流，從而使枯草芽孢桿菌高效合成葡萄糖二酸。通過動態下調糖酵解途徑中的pgi基因，戊糖磷酸途徑中的zwf基因和動態上調葡萄糖二酸合成途徑中ino1基因的表達，葡萄糖二酸的搖瓶產量提高了154%，而傳統的靜態調控策略僅提高35%。動態調控菌株中的丙酮酸含量出現了振幅式變化，證明所建立的反饋迴路成功動態控制了枯草芽孢桿菌的中心碳代謝途徑。

枯草芽孢桿菌中葡萄糖二酸合成的動態調控

據悉，江南大學博士生徐顯皓為該論文的第一作者，陳堅院士和劉龍教授為該論文的共同通訊作者。該研究工作得到了國家自然科學基金（31870069，31930085，21676119）國家重點研發計劃(2018YFA0900300，2018YFA0900504)、江蘇省研究生科研創新計劃（KYCX18_1786）、中央高校基本科研專項資金（JUSRP51713B）和BBSRC (BB/R01602X/1)的資助。

論文連結：

https://www.nature.com/articles/s41589-020-0637-3