植物水楊酸信號途徑先驅董欣年美國科學院院士與NPR1的故事

杜克大學女科學家董欣年（Xinnian Dong）教授，其早年畢業於武漢大學，父親是有「一代經濟學泰鬥」之稱的董輔礽。母親劉藹年，是中國著名眼科醫生、教授。一家都是武漢大學校友。她參加首屆「中美生物化學聯合招生項目」（CUSBEA，發起人為吳瑞教授），獲得留美資格。1988年獲得西北大學分子生物學博士學位，1988年-1991年在哈佛大學師從Ausubel博士後研究，2012年當選為美國國家科學院院士。董欣年院士主要研究方向為水楊酸介導的信號轉導途徑。

她的學生中包括武漢大學胥國勇、加拿大哥倫比亞大學張躍林，李辛，美國佛羅裡大學牟周林，北京大學王偉和以及首都師範大學周冕等。最喜歡讀的文章The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N:similarity to Toll and the interleukin-1 receptor』 (Cell (1994) 78, 1101–1115)。

在開始研究時，沒有報導形態表型與系統性抗性SAR信號傳導相關的突變體。BGL2基因是SA調控的PR基因之一。為了解決這個問題，用響應抗性誘導信號的報告基因轉化擬南芥，該報導基因含有BGL2的啟動子和GUS編碼區。我們的篩選理由是報告基因應該反映內源性PR基因的表達，並且在尋找報告基因異常表達的突變體時，我們將鑑定影響SAR調節的突變。因此用含有編碼p-1,3-葡聚糖酶的PR基因（BGL2）啟動子和B-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）編碼區的報告基因轉化擬南芥。誘變所得的轉基因植株系（BGL2-GUS），並對後代的組成型GUS活性進行分析。發現了一個突變體cpri（PR基因的組成型表達）的特徵，該突變體在此篩選中被鑑定，並通過RNA凝膠印跡分析顯示也具有升高的內源PR基因BGL2，PR-1和PR-5的表達。遺傳分析表明，cpr1賦予的表型是由單個隱性核突變引起的，並且在產生細菌水楊酸羥化酶的植物中被抑制。

用同樣的方法，EMS誘變BGL2-GUS轉基因植物，並篩選M2植物的SA或INA無應答突變體。測定在0.5mM SA或0.1mM INA存在下生長的單個植物的GUS活性。在測試的13468個M2植物中，181個在SA或INA存在下不顯示GUS活性。在M3代中，139個測試品系中的77個保持GUS活性的突變表型，其中76個對SA和INA無反應，一個對SA無反應但對INA有反應。篩選到npr1基因，隱性突變體。在NPR1缺陷突變體不能響應各種SAR誘導處理，表現出很少的病程相關（PR）基因表達並且表現出易於感病。使用基於圖譜的方法克隆NPR1，發現其編碼含有錨蛋白重複序列的新蛋白質。npr1突變等位基因中的突變破壞了錨蛋白共有序列，表明這些重複對於npr1功能是重要的。此外，將克隆的野生型NPR1基因轉化為NPR1突變體不僅補充了突變，恢復了對PR基因表達和對感染的抗性的SAR誘導的響應性，而且還使轉基因植物對細菌感染更具抗性。我們發現NPR1以劑量依賴性方式賦予對病原體丁香假單胞菌和寄生蟲Peronospora的抗性。NPR1的過表達導致抗性增強，對植物沒有明顯的不利影響。

Scientist Art 發起了一個讀者討論這個發現信號通路的套路，你還見過嗎？

基因功能研究的套路來了：

董欣年實驗室的李辛（目前在加拿大哥倫比亞大學）發現，擬南芥NPR1基因是SAR的正調節因子，對轉導SAR信號水楊酸（SA）至關重要。NPR1基因的突變消除了SA誘導的發病相關（PR）基因的表達和對病原體的抗性。為了確定SAR的其他應答因子，我們篩選了npr1-1的抑制因子。在npr1-1背景中，sni1（npr1-1的抑制子，誘導型1）突變體在誘導後顯示接近野生型的PR1表達水平和對病原體的抗性。通過隱性sni1突變恢復npr1-1中的SAR表明野生型sni1可以作為SAR的負調節因子。我們克隆了SNI1基因，發現它編碼富含亮氨酸的核蛋白。

董欣年實驗室的張躍林（目前在加拿大哥倫比亞大學，之前在NIBS工作），發現在酵母雙雜交篩選中使用NPR1作為誘餌，鑑定了轉錄因子的亞類即鹼性亮氨酸拉鏈蛋白家族（AHBP-1b和TGA6），並顯示它們在酵母中和體外與NPR1特異性相互作用。在擬南芥中消除NPR1功能的點突變，也阻斷NPR1與轉錄因子之間的酵母雙雜交相互作用。此外，凝膠遷移率變動分析顯示純化的轉錄因子蛋白AHBP-1b特異性結合擬南芥PR-1基因的SA反應性啟動子元件。這些數據表明NPR1可通過與鹼性亮氨酸拉鏈蛋白轉錄因子的亞類相互作用來調節PR-1基因表達。

分析了NPR1的亞細胞定位，以深入了解這種蛋白質調節SAR的機制。NPR1-綠色螢光蛋白融合蛋白，其功能與內源性NPR1蛋白相同，在響應SAR激活劑是顯示在細胞核中積累。為了控制NPR1的核轉運，將NPR1與糖皮質激素受體激素結合結構域融合。使用這種類固醇誘導系統，證明NPR1的核定位對於其誘導PR基因的活性是必需的。

後續工作集中闡述TGA和NPR1抑制子是如何work？

TGA轉錄因子在酵母雙雜交測定中對NPR1具有不同的親和力，其中TGA2（之前稱為AHBP-1b），TGA3和TGA6顯示最強的結合。TGA因子與as-1元件的結合親和力和特異性也不同。這些結果表明，一些TGA因子可能具有冗餘或重疊功能，而其他因子可能在調節植物防禦和其他生物過程中的基因中發揮不同的作用。此外，TGA因子可通過其高度保守的bZIP結構域形成同二聚體和異二聚體，進一步增強這些轉錄因子的多功能性（Foster等，1994；Lam和Lam，1995）。但是，這些特性使得很難定義任何特定TGA因子的功能。實際上，在TGA2，TGA3和TGA6基因中發現這些擬南芥突變體尚未檢測到表型，表明這些NPR1相互作用的TGA因子在功能上至少部分冗餘。TGA2轉錄因子由三個不同的結構域組成：N-末端結構域，其影響穩定性和可能的蛋白質的轉錄激活活性；bZIP結構域（bZIP；胺基酸47至94），它參與DNA結合和二聚化；以及C末端結構域，足以與酵母中的NPR1相互作用的區域。

在擬南芥中表達了截短形式的TGA2CT，發現所得的轉基因植株顯示出與npr1突變體相似的表型。TGA2突變體的這種顯性負效應表明TGA2和NPR1在植物中相互作用。我們還提供了生化證據，表明這種相互作用是特異性的，並通過SA處理得到增強。此外，使用嵌合報告系統，我們發現嵌合TGA2-GAL4轉錄因子響應於SA激活UAS（GAL）：：GUS報告基因，並且該激活在npr1突變體中被消除。NPR1是轉錄因子的DNA結合活性所必需的。這些遺傳數據清楚地表明TGA2是SA響應性和NPR1依賴性轉錄激活因子。

在病原菌未誘導狀態下，NPR1以通過分子間二硫鍵形成的低聚體形式存在。在SAR誘導後，發生細胞還原電位的變化，導致NPR1還原成單體形式。單體NPR1在細胞核中積累並激活基因表達。NPR1還原的抑制阻止防禦基因表達，而NPR1中Cys82或Cys216的突變導致NPR1持續單體化，突變蛋白核定位和防禦基因表達。這些數據提供了SAR信號通路中SA積累和NPR1激活之間缺失的聯繫。S-亞硝基穀胱甘肽（GSNO）在半胱氨酸-156處對NPR1的S-亞硝基化促進其寡聚化，其在SA誘導後維持蛋白質穩態。相反，SA誘導的NPR1低聚物-單體反應由硫氧還蛋白（TRXs）催化。NPR1半胱氨酸-156和TRX中的突變都削弱了了NPR1介導的疾病抗性。因此，NPR1的調節是通過GSNO和TRX的相反作用實現的。NPR1的核定位是一個關鍵的調控步驟，但如何在細胞核中調節蛋白質尚不清楚。核NPR1蛋白的轉換在調節其靶基因的轉錄中起重要作用。在沒有病原體攻擊的情況下，NPR1被蛋白酶體連續從細胞核中清除，這限制了其共激活因子活性，以防止SAR的過早激活。令人驚訝的是，SAR的誘導劑促進殘基Ser11/Ser15處的NPR1磷酸化，然後促進其募集至基於Cullin3的泛素連接酶。磷酸化NPR1的轉換是誘導靶基因和建立SAR所必需的。這些體內數據證明了共激活因子轉換在阻止和刺激基因轉錄以調節植物免疫中的雙重作用。

擬南芥SNI1（用於抑制NPR1，誘導型）是抑制PR基因基礎表達所需的SAR負調節因子。全基因組轉錄譜分析表明，在sni1突變體中，非表達PR基因（NPR1）依賴性苯並噻二唑S-甲酯應答基因的被特異性地抑制。有趣的是，SNI1在酵母中表達時也抑制轉錄，表明它通過高度保守的機制起到活性轉錄抑制因子的作用。染色質免疫沉澱表明組蛋白修飾可能參與SNI1介導的抑制。與其他植物物種中的直向同源物的序列比較和SNI1的飽和NAAIRS掃描誘變鑑定了SNI1中其活性所需的區域。SNI1與Armadillo重複蛋白的結構相似性意味著SNI1可以形成與調節轉錄的蛋白質相互作用的支架。在sni1抑制基因的遺傳篩選中，我們發現RAD51D是NPR1非依賴性PR基因表達所必需的。結果發現rad51d突變體具有增強的疾病易感性。除了改變PR基因表達外，rad51d植物對DNA損傷劑過敏，並且在同源重組中受損。RAD51D和SNI1在PR基因轉錄和DNA重組中的雙重作用提示了短期防禦反應和長期生存策略之間的分子機制聯繫。SNI1是SAR和HR的負調控因子，如SNI1突變體中防禦基因和HR的基礎表達增加。我們發現sni1表型是由乳腺癌2（BRCA2）突變所拯救的。在人類中，BRCA2是同源DNA配對中RAD51的介體。BRCA2中的突變會導致乳腺癌/卵巢癌的易感性；但是，BRCA2-RAD51複合物在轉錄調控中的作用仍不清楚。在擬南芥中，發現brca2和rad51不僅對遺傳毒性物質過敏，而且對病原體感染也過敏。全基因組微陣列分析顯示，在NPR1的下遊，BRCA2A是防禦相關基因轉錄的主要調節因子。ChIP證明RAD51在SAR期間被特異性地募集到防禦基因的啟動子。這種招募取決於SAR信號水楊酸（SA）和BRCA2的功能。這項研究提供了分子證據，表明以其在HR中的功能而聞名的BRCA2-RAD51複合物在植物免疫應答過程中的轉錄調控中也起著直接而特定的作用。系統獲得性抗性（SAR）是一種對局部感染的誘導型植物防禦反應，需要信號分子水楊酸（SA）和轉錄共激活因子NPR1，協同激活發病相關（PR）基因。擬南芥sni1是npr1抑制劑，sni1中防禦基因的去阻遏導致生長和生育能力降低，同源重組增加。鑑定DNA損傷修復蛋白SSN2和RAD51D作為sni1的遺傳和物理相互作用。在植物防禦期間，SSN2和可能的RAD51D在發病相關基因啟動子處取代轉錄抑制因子SNI1。在SNI1的存在下，NPR1也是SSN2結合所必需的。因此，SNI1、SSN2-RAD51D和NPR1的協同作用確保了植物免疫基因表達的嚴格控制。鑑於SSN2-RAD51D複合物在真核生物中是保守的，它們在同源重組和植物防禦基因轉錄調控中的雙重功能表明這兩種應激反應之間存在一般聯繫。

TGA轉錄因子被認為是病程相關基因的調節因子，因為它們與已知的正調節因子NPR1發生物理相互作用。先前顯示三重敲除突變體tga2-1 tga5-1 tga6-1在PR基因的誘導和系統獲得性抗性方面存在缺陷，證實了它們在抗病性中的作用。但是，由於這些因素之間的功能冗餘以及某些單一因素的可能雙重功能，很難辨別各個TGA因素的貢獻。通過反向遺傳學表徵了六個TGA因子。TGA3是基礎和2,6-二氯異煙酸誘導的PR基因轉錄所必需的。tga3-1突變體在基礎病原體抗性方面存在缺陷，而誘導抗性不受影響。TGA1和TGA4在基礎抗性的調節中起部分冗餘作用，對PR基因表達僅具有中等作用。此外，TGA6的激活標記突變體能夠增加PR1的基礎表達和誘導表達，證明TGA6對PR基因表達具有積極作用。相反，TGA2對PR基因表達具有阻遏物活性，即使它可以在tga5-1 tga6-1無效突變體背景中充當正調節劑。最後，我們檢測了tga2-2與npr1誘導型1（sni1-1）抑制子之間的遺傳相互作用。TGA2的阻遏物活性與SNI1重疊，因為TGA2-2SNI1-1雙突變體對PR基因表達具有協同作用。

NPR1雖然很重要，但它單獨卻並不與SA激素結合。NPR1旁系同源物NPR3和NPR4是以不同親和力結合SA的SA受體。NPR3和NPR4充當Cullin 3泛素E3連接酶的銜接子，以SA調節的方式介導NPR1降解。因此，擬南芥npr3 npr4雙突變體積累更高水平的NPR1，並且對誘導系統獲得性抗性不敏感。而且，該突變體在病原體效應子觸發的程序性細胞死亡和免疫方面是有缺陷的，揭示了SA感知在確定響應病原體攻擊的細胞死亡和存活中的機制。

如果NPR1基因一直處於激活狀態，植物的生長就會受到嚴重影響。為了能讓NPR1這個主調節者發揮作用，研究人員需要給它安上一個開關，使它只有在植物遭受攻擊的時候才「打開」，並在植物正常生長的時候進入「關閉」狀態。BF1蛋白會在植物啟動免疫反應後快速產生，並啟動下遊的免疫通路。植物能在感受到威脅的情況下，快速將TBF1的mRNA送去翻譯，產生大量TBF1蛋白用於防禦。這個特殊的現象背後，是編碼TBF1的基因前一段特殊的DNA序列。