​ChemBioChem | 高覆蓋度分析人半胱氨酸組的化學蛋白質組技術

2021-02-19 王初課題組
大家好，今天給大家分享一篇最近發表在ChemBioChem上的文章，題目是「SP3-FAIMS chemoproteomics for high coverage profiling of the human cysteinome」, 文章的通訊作者是來自美國加州大學洛杉磯分校的Keriann M. Backus教授。Backus教授的研究興趣是化學蛋白質組學以及化學生物學。在本文中，作者對發展了高覆蓋度分析半胱氨酸組的化學蛋白質組技術。

化學蛋白質組學能夠分析鑑定蛋白質中具有反應活性和功能性的胺基酸位點，從而找到潛在的藥物靶點。半胱氨酸由於其側鏈的巰基對氧化還原壓力敏感且能夠有金屬離子結合，且該位點上存在多種翻譯後修飾，因此對蛋白質組中半胱氨酸位點的全面鑑定將為後續潛在藥物的開發提供豐度的線索。基於活性的化學蛋白質組學技術（ABPP）利用親電性的化學探針，如碘乙醯胺的炔基探針（IAA），標記半胱氨酸位點後，隨後進行點擊化學反應將肽段標記上生物素，最後再進行富集和質譜鑑定。作者在之前的研究中發展了固相增強樣品製備蛋白提取技術（SP3），該技術利用修飾羧基的磁珠與蛋白或肽段相互作用後再進行洗脫，能夠快速的去除過量的生物素試劑。因此在本文中，作者將這種SP3技術取代傳統的甲醇/氯仿的沉澱，並且結合高場非對稱波形離子淌度質譜技術（FAIMS），將其應用到分析人半胱氨酸組的化學蛋白質組技術中，大大提高了對人半胱氨酸組鑑定的覆蓋度。

作者首先對標記半胱氨酸的IAA探針濃度以及隨後進行點擊化學反應的疊氮-生物素標籤（biotin-azide）濃度進行了優化，發現2 mM的IAA以及4 mM的biotin-azide是能夠使肽段生物素化的最優濃度。隨後作者比較了SP3技術和傳統的甲醇/氯仿的沉澱兩種方式去除過量的biotin-azide後，質譜鑑定半胱氨酸的位點數目，發現SP3技術鑑定的半胱氨酸位點數目遠高於傳統的甲醇/氯仿的沉澱方法。

隨後作者對FAIMS中的內部補償電壓以及色譜條件進行了優化，最大限度的提升化學蛋白組學鑑定半胱氨酸位點的數目。隨後作者利用優化好的SP3-FAIMS化學蛋白質組學技術，對人源的不同六個細胞系進行了大規模的半胱氨酸位點分析，使用不同的酶切類型以及亞細胞器分離等方式，共鑑定出34,225個半胱氨酸位點。作者將理論上質譜可以鑑定到的半胱氨酸位點進行了分析，在所有261,865個半胱氨酸位點中，理論上可以質譜鑑定到半胱氨酸位點數目為204,707個，而該文章鑑定到的34,225個位點佔可理論鑑定的位點的比例大約為16.7 %，相比之前鑑定的3%比例有大幅度的提升。最後作者將SP3-FAIMS化學蛋白質組學技術與isoTOP-ABPP結合，對一種小分子化合物靶向的半胱氨酸位點進行分析，最終比傳統的化學蛋白質組學技術中多鑑定到168%可靶向半胱氨酸位點，且蛋白用量僅為200 μg，遠小於傳統技術需要的1.5 mg蛋白。

總之，作者將之前發展的SP3技術應用到化學蛋白質組學中，能夠高效去除小分子和純化蛋白，並且結合FAIMS技術後，在降低蛋白用量的同時上還能大幅度的提升鑑定到的半胱氨酸位點覆蓋度。

 

本文作者：TH

責任編輯：LYP

原文連結：

https://chemistry-europe.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cbic.202000870

原文引用：DOI: 10.1002/cbic.202000870

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