淺談核磁共振(NMR)在生物製藥領域的應用

近年來隨著核磁共振（NMR）技術在自動化、靈敏度、解析度、脈衝序列和譜圖處理方面的進步，NMR在生物製藥領域的應用越來越多，本文簡單匯總NMR在這方面的應用進展。NMR和紅外光譜、紫外光譜一樣，也是一種能譜，主要是研究一些特定的原子核（1H、13C、15N、31P、19F等）在強磁場中吸收一定頻率電磁波實現共振躍遷的現象，記錄共振時的信號位置和強度就是NMR譜。具體詳細原理不在本文討論範圍，感興趣的讀者可以翻閱相關教程。下面按照藥物研發進程，分別談談NMR在生物藥的發現（discovery）和開發（development）階段的應用。（1） 表位分析（Epitope mapping）表位分析在抗體藥物發現中有很重要的意義，一方面是可以加深對於抗體作用機理的認識，一方面可以申請專利保護。目前常用的技術手段有氫氘交換（HDX-MS）、X-ray晶體衍射、NMR、高通量構建突變體的short-gun mutagenesis、peptide array等。這些方法中X-ray晶體衍射是能獲得最完整的表位信息，可以直觀的看到抗原抗體複合物的三維空間結構，但是高質量的晶體和衍射數據通常不是很容易獲得。下面介紹一下NMR如何應用於表位分析。NMR的表位分析是由於NMR信號對局部的化學環境（chemical environment）非常敏感。當抗體抗原形成複合物時，位於蛋白-蛋白相互作用（protein-protein contacts）表面的胺基酸殘基（interface residues）的化學環境發生改變，不再是抗原和溶劑的相互作用狀態。這個化學環境的改變最終以改變的化學位移信號展現出來。因此，抗體抗原相互作用的界面胺基酸可以很輕易的通過比對抗原的原有NMR譜圖和加入抗體後的譜圖比對得出。通常情況，NMR的表位分析都是採集15N-HSQC二維譜，理論上在該譜中，抗原的主鏈胺基酸（Proline除外）的NH基團都會產生一個NMR信號。這些信號對蛋白質的構象或化學環境非常敏感。通過比對單獨的15N標記的抗原蛋白15N-HSQC譜在加入無標記的抗體蛋白前後的譜圖差異，可以獲得抗原抗體結合表面的胺基酸殘基信息（如圖一所示）。另一問題，這些HSQC二維譜中發生偏移的信號究竟屬於抗原的哪個胺基酸呢，這就需要另一個實驗來解決。通常是表達出15N和13C標記的抗原蛋白，進行典型的三共振NMR實驗獲得三維圖譜，指認出NMR圖譜中的胺基酸殘基信息。採用該方法進行表位分析的優勢在於，一旦獲得標記的抗原蛋白圖譜信息，可以針對該抗原的所有候選抗體進行滴定和表位分析，非常快捷方便。

圖一 NMR表位分析典型圖譜

（2） 培養基和代謝物分析

眾所周知，上遊發酵工藝對生物藥的質量有很重要的影響，而培養基和代謝物的分析對於上遊發酵工藝開發很關鍵。除了Nova這類設備監測關鍵的幾個胺基酸和代謝物之外，一般用的比較多的分析方法是液相和LC/MS進行胺基酸及代謝產物的分析。NMR方法應用於細胞培養基和代謝物的分析大概開始於十年前。NMR方法需要的樣品量少，樣品處理非常簡單（1份樣品加上3份的含有重水的緩衝液即可，重水用來抑制溶劑峰），不需要分離，直接加入核磁管即可進行檢測，並且定量準確。下圖二是一個典型的培養基和代謝物分析的一維NMR譜圖。儘可能使用高場的核磁譜儀可以獲得更好的靈敏度，經過優化該方法可以檢測多達50種培養基成分和代謝產物，雖然和當前流行的LC/MS檢測相比有一定差距，但是已經可以滿足大多數應用場景需求，並且方法本身在實驗室間的重現性非常良好。

圖二A: 250L fed-batch培養上清第12天；B: 培養上清第4天（黑色），6天（藍色），8天（綠色），10天（紅色）

（3） 可比性研究/生物類似藥的構象比較

在蛋白藥物的開發生命周期中，通常會經歷多次的工藝變更，例如培養基變更，上遊發酵培養工藝、下遊純化工藝的優化等等。為了證明變更不會影響產品的質量，可比性研究是必不可少的一部分。蛋白質的三維結構和功能直接相關，因此蛋白藥物的高級結構HOS（High order structure）通常被認為是CQA，在可比性研究中也是必需的數據。HOS的表徵有一定挑戰，當前常用的方法包括紅外（IR）、差式掃描微量熱（DSC）、圓二色譜（CD）、螢光法等，但是這類方法的靈敏度和解析度都較低，對於蛋白的局部構象改變並不敏感。近些年，NMR在蛋白藥物的高級結構表徵方面的應用受到越來越多的關注。今年發表在Journal of pharmaceutical science上的一篇文章比較了當前常用的這些HOS的研究方法，結論很有意思。

圖三 IgG1和IgG2混合樣品，所有樣品均在同樣的製劑buffer體系。

作者準備了如圖三所示的IgG2和IgG1的樣品以及各種比例的混合，並採用各種HOS分析方法採集數據，通過專業的軟體來對比圖譜差異或相似度。二級結構的分析採用了遠紫外CD和FTIR方法。圖四為IgG1和IgG2樣品以及它們兩者不同比例混合的樣品圖譜，每個樣品都平行測三次，令人驚訝的是除了100%的IgG1和100%的IgG2樣品圖譜，其他比例混合的樣品圖譜通過FTIR或者遠紫外CD都不能很好的區分。

圖四IgG1和IgG2及不同比例混合樣品的圖譜，左為紅外圖譜，右為遠紫外CD譜圖五IgG1和IgG2及不同比例混合樣品的圖譜，左為近紫外CD，右為Intrinsic螢光

圖六IgG1和IgG2及不同比例混合樣品的圖譜，左為DSC，右為一維NMR譜。

三級結構圖譜的比較採用了近紫外CD、蛋白內在螢光、DSC和一維NMR。通過圖五的結果可以看出，近紫外CD和內在螢光也並不能很好的區分這些不同混合比例的樣品。DSC的表現比前兩種方法要好很多，已經能夠區分大半的樣品。這些方法中最靈敏的還是一維NMR圖譜，能夠區分開絕大多數的樣品，化學位移對環境非常敏感。該一維NMR方法採用的是profile NMR，製劑輔料的信號被很好的抑制，確保只有蛋白的信號展現。

早期限制NMR在醫藥研發上面的應用是二維NMR核磁譜的獲得必須使用13C或15N標記的樣品，而近些年核磁譜儀設備以及脈衝序列設計的進步使得採集天然豐度13C或15N的NMR二維譜成為可能，蛋白藥物樣品無需標記也可用於實驗。如圖七所示，採用天然豐度的13C採集的NIST抗體HSQC譜，另外對該抗體進行papain酶切後按照2:1摩爾比例混合後的Fab和Fc圖譜疊加圖，和全長圖譜非常類似。得益於技術的進步，該Fab和Fc圖譜的採集時間可以縮短至半小時，效率很高。目前有報導生物類似藥的構象對比採用該方法，採集的圖譜應用PCA或者類似的生物信息學軟體對每一個peak進行強度和化學位移的比對，確定相似度。

圖七HSQC譜，A: 全長NIST抗體，B: NIST抗體在酶切後按照Fab:Fc摩爾比2:1混合

（4） 製劑開發

隨著皮下注射製劑越來越流行，高濃度的抗體製劑開發成為趨勢。在高濃度情況下，抗體容易沉澱或者發生聚集（self-association）。為了研究這種狀況下的抗體狀態和聚集，需要採用多種正交的方法進行分析，因為當前很多分析方法的檢測濃度範圍有一定限制，很多時候需要稀釋進行檢測。但是一旦稀釋，樣品的狀態不一定能反映高濃度的真實狀況。近幾年流行的一個方法是採用NMR來分析製劑樣品，分析在不同輔料和濃度下抗體樣品的狀態。因為NMR信號採集不需要稀釋樣品，而且是原位（in situ）檢測。

如圖八展示的典型抗體製劑的一維核磁1H譜，其中在2.7ppm左右的是檸檬酸的信號。處於高場（high field）的信號通常可以用來分析抗體的狀態，當抗體處於聚集狀態時信號強度會變弱。圖九展示了不同pH的高濃度抗體製劑溶液中，加入不同濃度的Arg.Glu（精氨酸和穀氨酸的組合）輔料的NMR圖譜。從圖中可以看出200mg/ml的抗體製劑樣品和40mg/ml的樣品相比，聚集傾向明顯，而隨著加入的Arg.Glu濃度越來越高，NMR信號強度逐漸增強，說明處於單體狀態的抗體分子越來越多，樣品聚集程度下降。 圖九200mg/ml的抗體在pH6.0和7.0下加入0-200mM的Arg.Glu輔料的1H譜

圖十 C和D為NMR的1H譜的低場（氨基和芳香環信號），G和F為加速試驗下SEC檢測的monomer（Fmono）以及NMR統計的FAR和FNH信號強度對比。

圖十是比較抗體在加入200mM的Arg.Glu或200mM的Arg.HCl的溶液在40度加速試驗下的穩定性。從圖中NMR的數據可以看出，隨著時間推移，信號減弱明顯，但是在該案例中Arg.HCl的穩定效果更好。另外，從下面的兩幅數據比較可以看出，SEC檢測的monomer含量變化無法區分出兩種輔料的效果，而FNH（氨基信號）和FAR（芳香環信號）可以很顯著區分。SEC檢測需要稀釋樣品進入HPLC，這也反映了可能會有部分reversible的聚集在該分析中不能體現。這也就說明了該案例中in situ檢測分析樣品的重要性。

綜上，可以看出NMR在生物製藥領域有很多的應用潛力，目前這方面工作主要還是在跨國藥企中使用比較多，期待著未來國內企業也能將該技術應用到研發當中。1，Methods in Molecular Biology, vol. 1785, pp29-482，Peptalk 2019, slides from professor Feng Ni3，J. AM. CHEM. SOC. 2010, 132, 9531–95334，Journal of Pharmaceutical Sciences 109 (2020) 247-2535，Anal Chem. 2015;87:5539-5545.6，Scientific Reports, vol. 6, 32201 (2016)7.  mAbs, 2016, Vol. 8, NO. 7, 1245–1258