Microbiome:微生物在植物世代之間的旅程

微生物在植物世代之間的旅程

A microorganisms』 journey between plant generations

Microbiome

Impact Factor 10.465 | CiteScore 9.86

發表日期：2018-04-26

第一作者：Nathan Vannier1

通訊作者：Nathan Vannier1

合作作者：Cendrine Mony, Anne-Kristel Bittebiere, Sophie Michon-Coudouel, Marine Biget & Philippe Vandenkoornhuyse

主要單位：

1法國，雷恩大學（Université de Rennes 1, CNRS, UMR 6553 EcoBio, campus Beaulieu, Avenue du Général Leclerc, 35042, Rennes Cedex, Franc）

摘要

背景

植物被多種多樣的微生物所定植，這些微生物形成了一個菌群，並為它們的宿主執行額外的功能。因此，這種微生物群可以被認為是一個工具箱，使植物能夠緩衝性地適應當地環境變化，並對植物的適應性產生積極的影響。在這種情況下，微生物群向後代的傳播代表了一種確保在棲息地內存且在有益共生的方式。這類傳播的例子主要描述了種子傳播和一些致病微生物。我們研究了在無性系植物網絡中，共生夥伴向植物後代的傳播。

方法

我們以無性繁殖的植物金錢薄荷/斑葉連錢草(Glechoma hederacea)為植物模型，在控制微生物存在的同時，將新產生的無性繁殖後代置於分離的花盆中生根。我們使用16S和18S rRNA基因的擴增子測序方法分別針對細菌/古生菌和真菌來描述母本和克隆植物後代的根系菌群。

結果

我們證明了相當比例的母本植株共生細菌和真菌徑直傳遞給子代植株，有趣的是，古生菌並沒有傳播給子代植物。傳播的群落具有較低的豐富度，這表明在傳播過程中發生了過濾。我們發現在子代之間，微生物的傳播庫是相似的，構成了一個特定的微生物群的遺傳可能性，開啟了對植物全基因組的新理解。我們還發現，與母株之間的距離和生長時間對微生物群落傳播的豐富度有顯著影響。

結論

在該無性系植物中，微生物通過連接在個體間傳播，從而保證了新生植株的微生物夥伴的可用性以及微生物在宿主間的分散。這個先前未被描述的生態過程允許微生物在空間和跨植物世代傳播。由於絕大多數植物是無性繁殖的，因此這一過程可能是生態系統功能的強大驅動因素，並在廣泛的生態系統中促進植物和微生物群落的組裝。

關鍵字 克隆植物，微生物組，16S/18SrRNA，繼代傳播，微生物傳播

日報

https://www.mr-gut.cn/papers/read/1072581111

菌群縱向傳播維持植物共生功能體的延續

創作：小扣啊 審核：周暘

2018年05月11日

植物通過將菌群傳播給後代來確保有益共生體的存在；

以無性系植物歐活血丹作為模型研究母體和後代植株的根部菌群，發現多數母體植物的共生細菌和真菌垂直傳播給後代，但不傳播古菌；

傳播菌群的豐富度較低，說明存在菌株篩選過程；

傳播菌群在子代植株間相似度高，組成了一個特定的可遺傳微生物群，有助於理解植物共生功能體；

距離母株的距離和生長時間顯著影響傳播菌群的豐富度；

菌群傳播極大地推動了植物-菌群共生體的建立和運作。

主編推薦語(周暘): 共生菌群的縱向傳播現象也存在於植物中。通過研究共生菌群在無性系植物親代-子代之間的傳遞，本研究發現傳播菌群具有特定的結構，並且受到環境、生長時間的影響。本研究對於了解植物-菌群互作、植物共生功能體的維持具有重要參考價值，值得專業人士關注。

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背景

所有活著地植物都經歷過與內生微生物的相互作用，已知它們都有豐富多樣的共生體(即長期的相互作用達到穩定的平衡)。包括真菌、細菌和古菌，它們共同構成了植物的微生物群。利用玉米品種進行的研究表明，由寄主植物對微生物根際組成的遺傳控制是有限的，但也是可以檢測到的。因此，植物微生物群的組成，至少在一定程度上，不僅是可在周圍土壤中進行招募補充的微生物庫的結果，而且也是在植物內層進行植物選擇性招募補充的結果。這個過濾系統包括植物防禦和植物-微生物信號機制，以及通過對不太有益真菌的營養禁運來促進最佳合作者。

從理論上看，垂直和偽垂直傳輸（同源共生體從親本遺傳給共享一致環境的子代）是有利的，因為它們限制了尋找合適共生體的成本。垂直傳輸將因此允許在植物和它的共生體之間的「連續性的夥伴關係」。在這一背景下，微生物群的遺傳力也是植物保證其後代環境質量的一種途徑。在自然環境中，植物可以通過制種或克隆繁殖進行繁殖。一些研究證明了內生共生菌通過種子克隆寄主植物上進行垂直遺傳：最著名的例子可能是脅迫保護內生菌Neotyphodium coenocephalum在幾種草本植物中傳給後代。

最近的發現表明，形成無性系植物網絡的水平莖的營養伸長伴隨著包括叢枝菌根真菌在內的一群微生物向空間上遙遠的無性系後代的傳播。微生物對植物後代的這種遺傳力是不受環境（即，通過環境共享）或遺傳行為調節的。這一過程將支持克隆植物後代的生態位構建，而微生物可以受益於選擇性傳播載體，使它們能夠到達一個類似的、因此也是合適的宿主。克隆植物中的傳播已被證明涉及物理克隆（即，生理集成）中的信息和資源共享。如Stuefer等人之前所提出通過共享克隆網絡中的微生物，可能會出現一個額外的整合水平。

我們採用無性系草本種斑葉連錢草Glechoma hederacea作為模型。測試了通過克隆整合將微生物傳遞給克隆後代的假設，並提出了克隆植物中共享微生物群遺傳力的新概念。這種植物的生長形態是由水平莖(即空中匍匐莖)連接的小枝網絡構成的。這是最普遍的克隆形式之一。在無性系網絡生長過程中，產生的子分枝可以通過幹擾或分枝間物理連接的自然衰老從母株中分離出來，然後能夠自行生長和有性繁殖。10個生態型的植物在受控條件下生長。首先，將無根的幼枝(母株)移栽到裝有田間土壤的盆中。植物定向生長是通過強迫新排放的兩個分枝的小分枝(子分枝)在裝有滅菌基質的單獨的花盆中生根(圖1)。我們的目的是檢測存在於母株根中的內生微生物，並通過無性系匍匐莖轉移到子株。採用16S和18S rRNA基因的高通量擴增子測序進行檢測和鑑定在根內胚層和匍匐莖節間的細菌、古生菌和真菌。我們通過分析實驗中隨機分布的對照點用以刪除數據集中所有不能歸因於植物介導的微生物轉移的操作分類單元(OTUs)。

方法 Methods

生物材料 Biological material

我們使用無性系多年生草本植物金錢薄荷，這是研究無性系植物對環境約束反應的常用模型。金錢薄荷無性系體在斜向單軸匍匐莖上(即,在地面上連接)的節間每隔5至10釐米在節間產生新的直立的芽。每個無性系分株由兩個葉節點、一個根系統和兩個腋芽組成。在有控制條件的氣候室中及缺乏富集基質的情況下，金錢薄荷不著急開花，只顯示營養生長。在20℃下，在蛭石基質上生長3個月，晝夜循環12小時/12小時，以限制父本母本對其地理位置和棲息地的影響。營養繁殖是在無菌基質上進行的(50%砂，50%蛭石，120℃蒸壓2次，蒸壓1小時)。

實驗條件 Experimental conditions

實驗是在相同的無菌基質(50%的沙子，50%的蛭石)上進行的，條件也是白天12小時，夜晚12小時，溫度20°C。每2天用去離子水澆灌植物以保證水分。每10天用低磷水溶液給植物澆水以提供必要的營養有利於菌根化。每次澆水時，每盆去離子水和肥料溶液的體積為25毫升。為了檢測克隆網絡中微生物的傳播，我們將初始的無性系分株(ramet，母株)移栽到有田間土壤的花盆中，並使其定向生長以迫使新抽出的分株在不同的含有滅菌基質的花盆中生根(圖 1)。我們共使用了與上述10個生態型相對應的10個克隆片段。每一個母株產生由5個無性系分株(1株母株和4株子株)組成的克隆網絡(例如，50個根樣本)。在母株水平上分析菌群的組成，並與每個生態型的子株進行了比較。該設計基於10個重複，每個重複對應一個不同的生態型，能夠考慮響應於測試土壤組成的克隆片段的自然變異性。

圖1. 實驗設計。a. 10個生態型的無性系小分枝在單獨的花盆中生根，並被匍匐莖連接。在實驗結束時，克隆網絡由母株和四個子株組成。子分枝(第一和第二母株)沿著母株產生的兩個主匍匐莖排列。帶有母株的花盆填入均質化的田間土壤，帶有子株的花盆填入滅菌的基質，而接觸點僅由分隔兩個連續的分枝的節間連接。M-母株，D1-一代子株 D2-2代子株。b. 實驗設計圖片：這些小盆只通過節間連接。

它確保所觀察到的結果不是由於特定的生態型，而是作為金錢薄荷物種的一種普遍的模式。在實驗過程中，為了限制分枝的擴展和限制植株的生長，將子分枝的第二個分枝去除，形成一個簡單的網絡，由5個分枝組成，其中母分枝和4個分枝平均分布在兩個匍匐莖之間(每主匍匐莖2個)。利用兩個匍匐莖，我們可以檢驗在無性系內潛在的傳播是否是系統的，或者在匍匐莖之間傳播是否有變化(即，母株中生物體的隨機轉移)。移植的克隆單位(即，母系) 由一個成熟的分枝(葉和腋芽)和一個連接的匍匐莖節間組成(提供資源以支援無性系分株的生存)且無根(避免微生物先在根部定植)。在一個經常被修剪的生長著金錢薄荷種群的中生代草原上，靠近樹籬的接口處收集土壤。土壤是典型的以片巖為土壤母質的形成層。地上植物區系組成為5 ~ 10個不同的植物種類，L. perenne和T. repens被認為是最豐富的一種。然後通過0.5釐米的濾網過濾土壤，去除石頭和樹根。當無性系達到一個母株和四個有根的子株的階段時，實驗停止，收穫無性系。通過將母株和子株的無性系網絡分為匍匐莖節間、根和芽來分析根和節間樣品中內層微生物的組成。每個節間和根樣首先用水仔細清洗，然後用1% Triton×100 (Sigma)溶液清洗（三遍）最後是無菌水(5次)。這個過程確保了非內層微生物的去除。為了控制潛在的汙染，三個對照罐被隨機分配到實驗設計中。這些花盆都是用同樣的無菌底物，並且和其他花盆的澆水方式相似。在實驗結束時從這些對照罐中取樣，以便從序列分析和所有後續統計分析中去除所有非植物傳播的汙染微生物。在DNA提取和後續的分子工作進行之前，所有根、節間和底物樣品均在- 20℃冷凍。

DNA提取與擴增 DNA extraction and amplification

DNA提取自乾淨的根和節間（internodes），以及來自對照花盆的基質，使用的是DNeasy 植物迷你試劑盒(Qiagen)。18S rRNA基因通過利用真菌引物NS22b (5′-AATTAAG CAGACAAATCACT-3′) and SSU817 (5′-TTAGCATGG AATAATRRAATAGGA-3′)進行擴增。PCR的擴增條件為95℃初始變性4分鐘，35個循環，95°C 30秒，54°C 30秒，72℃持續1分鐘，最後一次延長時間為72°C持續7分鐘。利用細菌引物799F(5』-AACMGGATTAGATACCCK G-3 『) 和1223R (5 『 -CCATTGTAGTACGTGTGTA-3 『)擴增16S rRNA基因。PCR的擴增條件為94℃初始變性4分鐘，32個循環，94°C 30秒，54°C 30秒，72℃持續1分鐘，最後一次延長時間為72°C持續10分鐘。16S rRNA基因也通過巢式PCR擴增得到。第一個PCR引物是e Wo_17F (5′-ATTCY GGTTGATCCYGSCGRG-3′) and Ar_958R (5′-YC CGGCGTTGAMTCCAATT-3′) PCR的擴增條件為94℃初始變性2分鐘，35個循環，94°C 30秒，57.5°C 50秒，72℃持續50s，最後一次延長時間為72°C持續10分鐘。第二個PCR引物為Ar_109F (5′-A CKGCTCAGTAACACGT-3′) and Ar_915R (5′-GT GCTCCCCCGCCAATTCCT-3′) PCR的擴增條件為94℃初始變性4分鐘，32個循環，94°C 30秒，57°C 30秒，72℃持續1min，最後一次延長時間為72°C持續10分鐘。所有的擴增反應都是用Illumina公司RTG PCR beads (通用電氣醫療集團)和目標2μL提取出的DNA， 且PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行可視化檢測。

測序和數據整理 Sequencing and data trimming

所有PCR擴增產物均使用Agencourt AMPure XP試劑盒進行純化。純化後對擴增產物進行定量分析，並使用高靈敏度DNA晶片-生物分析儀(安捷倫)和Invitrogen螢光定量分析(Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒，ThermoFisher Scientific)對其質量進行檢測。

然後使用為Illumina準備的NEBNextUltra II DNA文庫試劑盒對所有PCR擴增產物進行末端修復和接頭連接(新英格蘭生物學實驗室)。隨著使用NEB next Ultra 2 multiplex oligo (雙索引，新英格蘭生物學實驗室)的一個PCR步驟進行樣本混合建庫。然後對混樣文庫進行定量，採用安捷倫高靈敏度DNA晶片的生物分析儀進行質量檢測，以及使用SmartChip martchip RT PCR (Takara-Wafergen)進行定量PCR。擴增子樣本按等摩爾濃度混合，採用LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche)進行定量PCR，產物在人類和環境基因組的Rennes平臺的Illumina MiSeq儀器上(法國)進行雙端測序(2×250)。數據整理由不同的步驟組成：引物去除(Cutadapt) 和抑制含有不明鹼基的序列。另外一個步驟是使用自製的腳本檢查序列方向。這種嚴格的數據調整產生了9,592,312個讀長。裁剪好的序列使用FROGS 流程進行分析。(bio-informatic workbench 「X. SIGENAE」 [http://www.sigenae.org/])。用自定義程序對古菌和真菌進行FROGS預處理，用FROGS標準程序對細菌讀長進行FROGS預處理。在這個預處理過程中，利用Flash對細菌讀長進行組裝。聚類步驟使用SWARM從而避免使用識別閾值對OTUs中的序列進行分組。按照流程設計者的建議，採用最大聚合距離為1，然後是第二步，最大聚合距離為3執行降噪步驟。使用FROGS嵌合體去除工具過濾嵌合體。為了避免人造OTU的影響，我們還使用了一個過濾器來保留至少三個樣本中存在序列的OTU。所有的統計分析也做了一個五樣本過濾器但結果相似。我們在此基於歸屬統計的結果僅提出R2真菌和R1古生菌這表明更好的歸屬質量。使用Silva 123 16S資料庫來確定細菌和古生菌OTUs的歸屬分類注釋，使用Silva 123 18S數據進行真菌OTUs的歸屬分類注釋。然後根據隸屬關係的質量以閾值至少為95%的覆蓋率和95%的BLAST一致率對OTUs進行過濾。在FROGS中使用嚴格參數使我們最終獲得了4068,634個細菌讀長、2,222,950個真菌讀長和113,008個古細菌讀長。使用R(版本3.3.0)採用vegan包中的「rarefaction」功能生成稀疏曲線。我們製作了根、匍匐莖以及對照盆栽樣品的細菌、真菌和古菌群落的平均稀疏曲線，以確定測序深度是否足以描述操作分類單元(OTUs)的預期數量。測序深度足夠詳細描述微生物群落(附圖1)。按樣本讀長的數量均質化，以便後續的統計分析。根據使用相同的R包對稀疏曲線的圖形觀察，將樣本歸一化到相同的讀長數量，在此步驟中，從數據集中刪除讀長數少於標準化值的樣本。有在對照花盆土壤中發現的OTU都被從數據集中移除。三個對照罐包含0個古細菌讀長。3個對照罐中有2個含有0個真菌讀長，我們發現最後一個對照罐中有19個OTU包含有3371個真菌讀長。三個對照處理也包含65378、33773和37587個細菌讀長且分別分布在153， 313和219 OTUs中。

序列數據可通過登錄號PRJEB20603在歐洲核苷酸檔案館獲得。真菌，細菌和古細菌處理後的數據集也可作為附加的材料是可用的。(附件文件2, 3 和 4)。

數據分析 Statistical analyses

將網絡內各分株的位置和匍匐莖記錄為兩個因素進行統計分析。我們考慮了網絡中的三個位置：母株，一代子株，二代子株。匍匐莖被視作一個因素兩個水平：在生長過程中生長出的一代和二代匍匐莖。我們分析了G. hederacea生態型中的遺傳力、豐富度和微生物裝配的組成。我們分別分析了真菌和細菌的裝配。我們未對古生菌數據進行統計分析，因為它們在母株根和匍匐莖節間中被發現但在子代根中未被發現。所有統計分析均使用R軟體進行。

遺傳力計算和零模型構建

Heritability calculation and null model construction

每個生態型的每個分類群的遺傳力被測量作為呈現早母株中OTUs的數量，並由至少兩個子株共享（我們還為第三子代第四子代測試了遺傳力的計算）。為了確定所觀察到的遺傳力是否能被隨機預測，我們將觀察到的遺傳力與一個零模型進行了比較。本程序旨在檢驗零假設，即來自母株的物種在每個子株中隨機分布，並不反映來自母株的特定組物種的選擇或傳播。它允許評估觀察到的遺傳力指數大於零分布下的期望的概率。我們通過隨機抽取母株池中微生物種類的樣本來生成子株的微生物的群落，為10個生態型中的每一個建立了一個零模型。對於母株池中的所有物種來說，物種抽樣的概率是相同的（即，與它們在母根中最初的豐富程度無關）。只有物種身份從一種模式改變到另一種模式而子代群落的物種豐富度保持不變。對於10個生態型內的每個子代植株群落，從母株池中隨機抽取9999個虛擬群落，並計算每個模型的遺傳力指數。當使用不太嚴格的遺傳力時，結果是相似的（例如，OTU至少出現在一個子株中）但遺傳力不能更嚴格，因為它會為大多數的零群落創建零繼承OTUs的零群落，從而高估了觀測值和隨機遺傳力值之間的差異。

對於每一個生態型, 我們計算了標準效果大小(SES), 根據Gotelli和McCabe的描述計算：SES =（Iobs Inull）/ σnull其中Iobs為實測遺傳力指標值，Inull是零分布的均值，σnull是其標準偏差。SES旨在量化各生態型遺傳力指數相對於零分布的方向和大小。負的SES值表示比隨機模型更低的遺傳力（母株中不存在的微生物種類的遺傳力），而正的SES值表示比隨機期望更高的遺傳力(母株微生物的遺傳力)。選擇性假設「greater」的單樣本t檢驗

然後將應用於SES值，以確定在檢查數據正態性之後它們是否顯著大於零。

通過線性混合模型分析豐富度

Analyses of richness through linear mixed models

豐富度以樣品中OTU的數量來計算。分別計算了細菌和真菌在整個群落和門級上的豐富度(各門OTU豐富度)。我們選擇這兩個尺度來檢測微生物豐富度的一般模式，並檢測這些模式在分類群之間的潛在變化。我們在門的尺度上進行分析，而不是在更精確的分類學水平上因為在較低的分類水平我們受到產生多隸屬關係的序列隸屬的約束。為了檢測豐富度是否受克隆網絡中樣本位置的影響，我們使用R包」 nlme 「和」 car 「中的」 lme 「和」 anova 「功能執行線性混合效應模型。最初我們測試了母株和子株基因豐富度的差異。然後，我們通過考慮植物生態型中無性系(第一子代或第二子代)和匍匐莖(第一代匍匐莖、第二代匍匐莖)的位置作為解釋變量，檢驗了第一和第二子代的豐富度差異。在混合模型中，通過考慮克隆(母株或子株)的位置及將匍匐莖作為固定因子，將植物生態型為隨機因子，從而控制生態型誘導的方差和統計依賴性。用殘差的圖形表示來驗證模型殘差的正態性並且必要時對數據進行對數或平方根轉換。對於一些在樣本中表現出低豐度的真菌和細菌群體，測試豐富性差異的模型並不能保證殘差的正態性，因此這些結果沒有被提出。

微生物群落組成分析

Analyses of microorganisms community composition

採用PLS-DA(偏最小二乘法判別分析)方法，檢測母株與子株之間、子株與子株之間的菌群組成是否存在顯著差異。PLS- DA由偏最小二乘回歸分析(PLS)組成，其中響應變量是分類的(y-block;描述生態型中的位置)，表示統計單元的類成員。這個程序使得確定是否x-blocks的方差可以被y-blocks顯著地解釋成為可能。x-blocks(OTUs豐度)在PLS-DA分析中使用自尺度算法(即，中心列為零均值，刻度為單位方差)。進行預處理。PLS-DA過程包括產生p值的交叉驗證步驟，p值表示PLS-DA方法關於數據集的有效性。PLS-DA程序也表達了統計敏感性表明模型效率的形式為誤分類樣本在類別模型所接受的類別中所佔的百分比。我們使用這個模型的目的是測試群落組成的方差，這個方差可以用分枝在克隆中的位置來解釋。根據所測試的組，整個數據集被細分為兩個或三個組(例如，母株vs一代子株vs二代子株，母株vs所有子株，一代子株vs二代子株)。

結果

古菌、細菌和真菌群落在Glechoma hederacea根中的分布

Archaeal, bacterial, and fungal communities in the roots ofGlechoma hederacea

在母株中發現了古菌(只有太古菌門Thaumarcheota)、真菌和細菌。子株中未檢出古菌，子株根中檢出真菌和細菌(Fig. 2)。通過比較從母株和子株的根中獲得的序列，發現在母株和子株中有100%相同的讀長的子集，分別佔子株真菌和細菌的讀長34和15%。遺傳力計算為在母株和至少兩個子株的根中發現的OTUs的數量，對於細菌從15到374個OTUs (μ= 100.2±118.6)即對於真菌為從0到12 OTUs (μ= 6.1±3.63),這取決於生態型。檢驗所觀察到的遺傳力是否高於隨機預測(即隨機分布OTUs)，我們使用了一種零模型方法，即在保持OTU豐富度不變的情況下，對實驗樣本中的真菌或細菌物種進行隨機識別。因此，對於每個生態型，我們通過從所有母株根群落(區域池)中取樣物種，隨機產生細菌和真菌子群落並將我們數據集中觀察到的遺傳力值與隨機遺傳力值的分布進行比較。零模型方法表明，所觀察到的群落中母株和子株根中的OTUs遺傳率顯著高於隨機預測的結果。(具有備擇假設「更高」的單樣本t檢驗，P G. hederacea無性系網絡中的傳播得到了清楚的證明。

傳播過程中微生物群落的過濾

Microbial communities filtration during transmission

內生微生物在傳播過程中經歷了強烈的過濾。子代根的真菌OTUs豐富度明顯低於母株根，母株群落平均有40個OTUs，而子株群落平均只有10個OTUs（線性混合模型，F1,31 = 280, P 圖2)。同樣顯著的模式在細菌中也被觀察到，母株菌群平均有800個OTUs，而子株菌群平均有100個OTUs（線性混合模型，F1,39 = 410, P)。觀察到傳播菌群的「低」豐富度表明，傳播菌群是從原始菌池(即，母株微生物群)中過濾出來的。生態型對傳播菌群的豐富度也有顯著影響(有關使用的統計數據和隨機因素的詳細信息，請參閱「方法」一節)。通過對母株和子株根中微生物的比較，發現在菌群傳播過程中，大多數門水平的豐度普遍下降。定殖於根中的真菌群落絕大多數來自子囊門(106 OTUs)和擔子菌屬(39 OTUs)，小部分來自腎小球菌門(24 OTUs，最近被認為是一個Glomeromycotina亞門)、接合菌群(7 OTUs)和壺菌群(4 OTUs) (圖2a)。子株根中的子囊門和腎小球菌門的平均OTU豐富度比母株根中的低, 而擔子菌門的OTU豐富度變化不明顯。這一引人注目的觀察結果清楚地表明存在一種依賴真菌的過濾機制。定植於根上細菌群落主要分布在3384個OTUs上，其中大部分屬於變形菌門(2009 OTUs)和擬桿菌門(715個OTUs)約佔所有序列的80%，其餘20%屬於6個附加門(Fig. 2b)。與真菌一致，在變形桿菌、擬桿菌、酸桿菌門、放線菌和厚壁菌門等門水平，子株根部的細菌OTU豐富度明顯低於母株根部。這一觀察結果表明，濾過機制對細菌門的影響是不顯著的。

圖2. 在無性系網絡的不同位置，根內胚層細菌和真菌群落的組成.

a. 在無性系網絡中不同位置的根樣品中發現的每個真菌門的平均OTUs數和所有門的平均總OTUs數(母株，第一子株，或第二子株)。豎條表示每個門的平均標準誤差。通過線性混合模型檢測克隆網絡中母株和子株OTUs豐富度的差異是顯著的P

b. 在無性系網絡中不同位置的根樣品中發現每個細菌門的平均OTUs數量和所有門的平均總OTUs數(母株，第一代子株或第二代子株)。豎條表示每個門的平均標準誤差。在無性系網絡中，用線性混合模型檢測母株與子株間OTU豐富度差異有顯著性P

特定微生物群的遺傳力

The heritability of a specific cohort of microorganisms

採用多元回歸和偏最小二乘判別分析方法(PLS-DA)，來評估母株和子代根系中微生物群落組成的差異(見上面材料和方法，附加文件1)。這種分析的優點是它能夠測試基於數據集中樣本的分組因素的假設(即，一個解釋因素)並獲得該因子的顯著性以及該因子解釋的方差部分。有了這個分析，整個數據集就可以被使用，相比NMDS方法，大部分的方差是守恆的。

該方法中樣本之間的距離如Bray-Curtis或Jaccard總結了樣本之間的方差。不論是真菌(PPLS-DA = 0.001, PMothers vs Daughters 圖3a)，還是細菌 (PPLS-DA = 0.001, PMothers vs Daughters)，相較於母株，子代群落組成有顯著的差異。這些母株和子株之間微生物群落組成的差異可以通過在傳播過程中觀察到的豐富度的減少來解釋。這些結果表明，原來的微生物池只有一部分是由母株傳給子株的(即，一組特定的生物體)。檢驗植物過濾對特定微生物群傳播的假設，我們使用PLS-DA程序比較子代根內的微生物群落組成。根部群落的組成在第一和第二子代間無顯著差異(PPLS-DA = 0.09真菌 與 PPLS-DA = 0.33細菌 ，從而證實了一組特定的生物體同樣地傳播給了所有生態型的子代植株。

圖3. 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。

a. 用PLS-DA檢測根細菌群落組成的位置(母株、一代子株和二代子株)的顯著性。

b. 用PLS-DA檢測根真菌群落組成的位置(母株、一代子株和二代子株)的顯著性。

模型中作為分組因子的組用圖表示。它們分別對應於母株、第一代子株和第二代子株。第一代和第二代分株獨立於它們所屬的匍匐莖被分組。本分析用於驗證克隆網絡中不同分枝位置的根具有相似的真菌和細菌群落組成的假設。各軸表示的方差百分比代表了分組因子所解釋的群落組成差異。

擴散距離和擴散時間的影響

Effect of dispersal distance and dispersal time

我們發現沿著匍匐莖的細菌群落的豐富度稀釋模式(線性混合模型，F1,18 = 6.13、P細菌群落豐富度也與擴散時間有關。另外，這些模式可能與克隆網絡每個節點的累積過濾效應有關，從而減少了傳播細菌的數量。相反，真菌群落沒有檢測到這些豐富度稀釋模式，這表明，要麼是傳播物種的散布不受限制，要麼是真菌群落在最初的傳播過程中已經被強烈過濾。這兩個非排他的假設得到了我們觀察到的母株和子株之間真菌群落豐富度減少的變化的支持，這種變化可能依賴於不同真菌分類群的生活史和散布特徵。

討論 Discussion

這項工作首次展示了一種特殊的植物內層微生物群(真菌和細菌)的垂直傳播和遺傳能力。我們的工作與以前證明的微生物在植物間通過共同的菌絲網絡傳播的工作相呼應。然而，微生物通過菌絲網絡的傳播不同於無性系網絡，因為無性系網絡不是由植物組織構成的，因此微生物上存在著的環境過濾器(即，選擇壓力)是不一樣的。在無性系植物中，植物的免疫系統應該對傳播的微生物施加強大的選擇壓力。與其他研究一樣，它支持將植物理解為一個複雜的實體，而不是一個獨立的實體，並與必須將植物及其微生物群視為整體的觀點一致。我們對微生物群傳播的演示支持這樣一種觀點即微生物群及其宿主構成一個聯合選擇單元。這一發現與微生物群的遺傳性這一觀點並不衝突(微生物成分在2017年的《杜利特爾和布斯》中被隱喻為「歌手」)，在無性系植物中，實際上包括一組選定功能的遺傳性(《杜利特爾與布斯》中的「歌」，2017)。因此，我們的工作突出了在整體實體中起作用的進化過程，並協調了整體和正在進行的鬥爭的進化方法。對於植物來說，沿著植物無性系網絡傳播的微生物群落延伸到微生物，這是之前證明的信息和資源的生理整合概念。這種集成的網絡體系結構對宏共生功能體組織的思想提出了質疑，宏共生功能體組織中無性系分株可以作為微生物的匯點或來源。這樣的結構可以保證共生功能體之間的交換，特別是在母源和子源之間「匯點」，從而增加了整個克隆體的適應性。事實上，一群已經通過植物過濾系統的微生物的遺傳為新定植環境的招募提供了可利用的微生物庫。這個微生物「工具箱」可以使植物迅速適應環境條件，從而在異質環境中提供適合的益處。這可能被同化為植物生態位建設，並在開拓新的棲息地時提供競爭優勢。從微生物的角度來看，這些匍匐莖植物可以被視為生態廊道，在一定程度上促進了植物的擴散。環境中除了繁殖體傳播，這個過程確保了傳播的有機體從一個合適的寄主傳播到另一個寄主。因此，當在新環境中定植生根時，傳播的共生夥伴可能受益於優先效應。因此，今後的工作需要加以解決

(i)克隆網絡中微生物傳播的方向(單向和雙向)以及

(ii)傳播機制的模式(主動或被動)，以及

(iii)在傳播過程中過濾以確定

(iv)該過程在生態系統中的重要性的微生物。

關於最後一個方面，植物群落以無性系植物為主，我們的研究結果證明了無性系植物在營養級間微生物傳播中的基本作用，揭示了植物克隆的一種新的生態功能。考慮到本文所展示的遺傳力過程影響了生態系統中的不同部位，由微生物群的過濾和無性系植物的轉移組成的這一新的生態系統過程是至關重要的。

結論

本研究的結果證實了克隆植物Glechoma hederacea的一部分微生物組傳遞到其無性系後代。我們證明只有少數特定的微生物被傳播，表明在傳輸過程中存在濾波過程。這些發現證實了在無性系世代之間特定微生物群的傳播，並影響了我們對植物共生功能體的理解。

在克隆植物中，連接在一個共同的網絡中不同的共生功能體，微生物可以相互交換，構成克隆生物的共生功能體的另一個層次的組織。