NIBS張二荃組發明在體監測基因轉錄的新方法

2021-01-16 BioArt

責編丨迦 漵


基因轉錄是生物學研究中的一個重要方向，基因的轉錄活性與動物和人的生理功能與行為密切相關。然而，現有的實驗手段很難在正常生理和行為條件下研究基因轉錄的活性。目前主要依靠Real-time PCR體外檢測，原位雜交和Luciferase報告基因等方法測量基因轉錄水平，存在活體檢測困難、實時性差、費時費力，實驗誤差大等缺點，且無法監測動物在不同行為條件下基因轉錄的活性。


4月2日，北京生命科學研究所張二荃實驗室和影像中心佔成課題組發明了一種在體監測基因轉錄的新方法，並首先將該方法用於長時間記錄自由活動小鼠的生物鐘基因。相關研究以「 Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice」為題發表在PNAS雜誌上。另據了解，該項新穎的實驗方法，詳細的實驗步驟及流程也已被實驗方法學雜誌JoVE正式接收。



據NIBS官網報導，2年前，張二荃課題組和佔成課題組合作團隊決定嘗試利用螢光蛋白作為報告基因，建立新的基因轉錄活性報告系統。張二荃實驗室的博士生梅龍經過不斷的比較和篩選，選擇了黃色螢光蛋白Venus作為報告基因，並成功構建了節律基因Cry1和Per2的報告載體。隨後，在培養細胞系上成功實現了對Cry1和Per2基因轉錄活性的監測。


梅龍將Cry1和Per2的報告載體包裝成腺相關病毒，通過微量注射到特定的腦區，成功表達在神經元中。針對節律研究時程長、穩定性要求高的特點，影像中心佔成課題組設計並構建了一套高通量的在體基因監測系統，實現了同步記錄動物行為與基因轉錄活性。


基於螢光報告系統的在體監測基因轉錄水平的新方法。（A）基於螢光(Fluorescence)報告基因的AAV病毒載體，在節律基因Cry1、Per2、Bmal1的啟動子序列之後連上由lox2272和loxP序列間隔的反向Venus螢光表達基因，在Cre重組酶的作用下Venus螢光表達；（B）激發光經光纖導入到大腦，激發出的Venus螢光信號，通過在體基因監測系統採集信號，螢光信號的強弱表徵基因轉錄活性；（C）Cry1基因6個月的穩定記錄，圖中灰色表示無燈光照明，白色表示有燈光照明。


用該在體基因監測系統，研究人員首次實現了對小鼠腦內Cry1基因長達6個月的穩定記錄；並結合Cre-loxp系統，研究了大腦視交叉上核SCN中VIP神經元的多個節律基因如何適應倒時差，發現僅8小時的時差提前會對Per2和Cry1基因的相位和振幅產生巨大的影響，這兩個節律基因需要6天時間才能徹底恢復到之前水平。


8小時的時差提前對Per2和Cry1基因的相位和振幅的影響


2017年諾貝爾生理學或醫學獎頒發給了發現「調控晝夜節律的分子機制」的三位科學家。生物節律基因的轉錄活性檢測對開展生物節律研究非常重要，現有的技術手段活體檢測困難、需要避光、實時性差，大大限制了節律調控機制的深入研究。


與原有的研究手段相比，新方法實現了多項技術突破：1）適合長時間連續記錄（長達數月），2）時間解析度高（每10分鐘監測一次基因水平），3）實驗動物可自由活動，4）光照是生物鐘最主要的調節因素，新方法無需避光，可改變動物光照條件。更為重要的是，通過設計合適的病毒載體或者轉基因小鼠，該方法將不僅僅限於生物節律研究，還可以用來研究各種生理條件下多種基因的表達和變化。



北生所張二荃實驗室PTN項目博士生梅龍為本文第一作者，佔成博士和張二荃博士為本文共同通訊作者。


聲明：上述圖文信息主要來自於NIBS官網，BioArt轉載時略有改動


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