二維凝膠電泳（2D PAGE）分離方法可以說已經成為蛋白質組學的代名詞了，是目前解決高度複雜蛋白質混合物的最有效方法之一。2D PAGE實際上是兩種不同分離類型的組合。在第一種情況下，等電聚焦電泳（IEF）根據等電點分解蛋白質；在第二種情況下，通過聚丙烯醯胺凝膠電泳進一步分解聚焦蛋白質（如圖1）。因此，2D PAGE通過等電點和分子量分別在第一維和第二維分解蛋白質。
圖1.2D-SDS-PAGE示意圖儘管2D PAGE是解決複雜蛋白質混合物的最有效方法，但自從20世紀70年代初首次引入後，它在許多年內都沒有得到廣泛應用，主要有兩個原因：（1）實施等電聚焦技術有一定難度；（2）將聚焦的蛋白質放入SDS PAGE凝膠中也存在困難。在最初的版本中，IEF步驟依賴於「管狀凝膠」，這個裝置很難設置並執行。此外，管狀凝膠中的pH梯度很難再現，獲得含有聚焦蛋白質的精細管凝膠以有效地轉移SDS PAGE平板凝膠中的蛋白質也是一項很有挑戰的技術。因此，2D PAGE很難進行，重複進行更難。
隨著新的2D PAGE專用系統的引入，這種情況有了很大的改善。該系統使用固定的pH梯度（IPG）條帶和相對簡單的硬體來促使蛋白質從IPG條帶轉移到SDS-PAGE平板凝膠中。IPG條帶以固定的pH梯度為基礎，其中多羧酸兩性聚合物被固定在載體上，可重現性地產生穩定的pH梯度。現在已經可以從各大供應商處獲得IPG條帶，他們可以在各種或寬或窄的pH範圍內提供可重複的分離。使用較窄的pH範圍有助於分離等電點高度相似的蛋白質。用緩衝液將該條帶水和，在電壓作用下將蛋白質緩慢加載到條帶中，然後增加電壓以實現聚焦。商用系統提供溫度控制以及高精度的電壓或電流控制，以促進可重複分離。
在聚焦之後，用含有硫醇還原劑和SDS的緩衝液處理條帶，然後連接到SDS-PAGE平板凝膠上。在這方面，含有聚焦蛋白的IPG條帶在1D-SDS-PAGE中充當「堆積」凝膠。然後在SDS-PAGE平板凝膠上以與1D SDS PAGE相同的方式分解蛋白質。
二維凝膠分離的蛋白質通過包括銀染法、考馬斯亮藍染色法和氨基黑染色法在內的常規染色技術實現可視化。其中，銀染法和螢光染色法是最靈敏的。儘管這些染色技術都有許多不同的方法，但並不是所有的方法都能與隨後的蛋白質分析相兼容。例如，用福馬林固定蛋白質的銀染法往往會將蛋白質固定在凝膠中，從而阻止蛋白質的消化和所有生成的肽的復原。類似的問題還源於凝膠長期暴露於醋酸中。因此，使用與隨後的消化和洗脫步驟相兼容的染色方法至關重要。
在聚焦步驟之後，用含有硫醇還原劑和SDS的緩衝液處理條帶，然後連接到SDS-PAGE平板凝膠。在這方面，含有聚焦蛋白的IPG條帶在ID-SDS-PAGE中充當「堆積」凝膠。然後在SDS-PAGE平板凝膠上以與ID-SDS-PAGE相同的方式分解蛋白質。
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