本文由吉康醫學研究院王亞軍博士撰文
歡迎點擊上方藍色「吉康醫學」關注我們
並點擊右上角「...」菜單，選擇「設為星標」
在生物體的細胞器、細胞和組織中，各種複雜的生理功能和代謝反應都由蛋白質所維持。蛋白質與基因組序列信息之間，並非「一一對應」的關係。轉錄後加工、翻譯調節及翻譯後加工等過程使得生物體總蛋白質數目遠遠超過有活性的基因數目。因此，蛋白質組 (proteome) 的概念應運而生。蛋白質組是指由在特定的生理、病理條件下一個基因組或一個細胞/組織表達的所有蛋白質。功能基因及其產物的鑑定、分離都需要高效、高解析度、微量樣品的分析鑑定技術，雙向電泳和質譜聯用已經成為相關實驗室的常用研究手段。隨著功能基因組時代和蛋白質組時代的到來，雙向電泳技術 (Two-dimensional Electrophoresis) 已經成為生物學研究的核心技術之一。
1975年，義大利生化學家O'Farrell發明了雙向電泳技術。它是利用蛋白質的帶電性和分子量大小的差異，通過兩次凝膠電泳達到分離蛋白質組的技術(圖1)。第一向電泳依據蛋白質的等電點不同，通過等電聚焦將帶不同淨電荷的蛋白質進行分離。在此基礎上，依據蛋白質分子量的不同進行第二向的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，將其分離。雙向電泳技術包括蛋白樣品製備、等電聚焦、在平衡液中平衡膠條和SDS-PAGE電泳等步驟。圖 1 雙向電泳操作示意圖
1 蛋白質樣品的製備
樣品製備是雙向電泳的第一步，其成功與否決定雙向電泳成敗的關鍵。由於雙向電泳所分析樣品的多樣性，沒有一種通用的製備方法適用於各種樣品。但有幾條共同的原則需要遵循：
(1)儘可能溶解全部蛋白質，打斷蛋白質之間的非共價鍵結合，使樣品中的蛋白質以分離的多肽鏈形式存在；
(2) 避免蛋白質的修飾作用和蛋白質的降解作用；
(3)避免脂類、核酸、鹽等物質的幹擾作用；
(4)蛋白質樣品與第一向電泳的相容性。對於組織細胞，首先需將其破碎，儘可能地將蛋白質組分溶解在緩衝液中，以便在適當的電泳條件下分離。組織細胞破碎的方法包括低滲、勻漿、超聲、反覆凍融等。而對於體液成分，如血清、腹水、尿液等，僅需經過稀釋、加熱變性、溶解於適當緩衝液便可用於雙向電泳。在製備蛋白質樣品的過程中，最好使用Dnase和RnaseA來降解核酸。如果蛋白質樣品中含有較多的核酸，會增加樣品的粘性並造成非斑點處的背景拖跡，甚至還可能封閉凝膠孔。在蛋白樣品裂解時，應以溶解儘可能多的蛋白質和保持在整個雙向電泳過程中蛋白質的溶解性為主要目標。對於水溶性蛋白，PBS和Tris緩衝液即可將其完全溶解 ，然而細胞中還有大量的疏水性蛋白(如膜蛋白)，很難溶於常規的緩衝液，因此增加疏水性蛋白的溶解度一直是很多學者奮鬥的目標。目前增加蛋白質溶解性的方法主要是使用變性劑，如尿素、硫脲，可以打破蛋白質的高級結構，打斷非共價連接。據報導，硫脲不僅對蛋白質有增溶效果，還有抑制蛋白酶活性的作用。去汙劑，如陰離子去汙劑SDS、非離子去汙劑 NP-40、TritonX-100、兩性離子去汙劑 CHAPS、SB3-10，可以打斷蛋白質分子或亞基間的疏水作用，增加蛋白質溶解性，其中只有非離子型和兩性離子型適於雙向電泳。帶有 12～16個碳原子烷基側鏈的氨基硫代內銨鹽，如 SB-10、CABS14、ABS16 等，與尿素和硫脲同時使用，對膜蛋白的增溶作用更為突出。最近的研究顯示，非離子去垢劑十二烷基麥芽苷和十六烷基乙二醇(decaethyleneglycol mono hexadecyl )對疏水性蛋白的增溶效果也非常明顯。還原劑可以打開二硫鍵，並在隨後的操作中保持蛋白質處於還原狀態，如二巰基蘇糖醇(DTT)、磷酸三丁酯(TBP)、羥乙基二硫化物(HED)。TBP 為非離子型還原劑，在較低濃度下(3～5 mmol/L)即可提高蛋白質溶解性，而且不會在電場中遷移，等電聚焦過程中可始終維持蛋白質的還原狀態，同時簡化了兩向轉移間的平衡操作。但由於TBP 溶解度有限且在溶液中不穩定，在溶脹和聚焦過 程中補充適量DTT是有幫助的(常用濃度為2 mmol/L TBP和65 mmol/L DTT)。用0.5 mol/L DTDE或100 mmol/L HED替代DTT也會提高鹼性蛋白質溶解性獲得很高的解析度，同時簡化了平衡操作。雖然含有變性劑、去汙劑 和還原劑的裂解液在很大程度上增加了蛋白質溶解性，但在聚焦時仍有一些蛋白在其等電點附近發生沉積。研究表明，一些蛋白質溶解需要一定的鹽濃度，可是高濃度的鹽離子不僅限制電壓升高，延長了聚焦時間，所形成的高電流會引起凝膠過熱甚至燒壞，所以樣品緩衝液中鹽濃度不能超過 40 mmol/L。而兩性電解質在一定程度可以緩解鹽離子濃度低的問題，且具有在聚焦過程中不改變 pH 梯度前提下提供穩定電導的能力。二次樣品製備的目的是去除幹擾雙向電泳的非蛋白物質(如鹽、酚類物質、脂類、多糖和核酸等)和阻止在雙向電泳譜中導致假點的多肽或蛋白修飾。
2 第一向電泳
第一向是等點聚焦電泳，等點聚焦是20 世紀60年代建立的蛋白質分離技術，基本原理是利用蛋白質或其它兩性分子等電點的不同，在一個穩定的、連續的 pH 梯度中進行分離和分析。IEF 具有解析度高(0.01pH 單位)、 抵消擴散作用、可使濃度較低的樣品達到高度濃縮等優點，不僅可以用來分離兩性大分子，還可以通過測定等電點來鑑定蛋白質。根據建立 pH 梯度的原理不同，可以分為載體兩性電解質pH 梯度(Carrier ampholytes pH gradients)和固相 pH 梯度(Immobilized pH gradients)。前者是在電場中通過兩性緩衝離子建立pH梯度，後者是將緩衝基團作為凝膠介質的一部分，解析度比前者提高一個數量級。根據電泳方式的不同，IEF 可分為管狀、薄層、垂直和水平等點聚焦。目前廣泛應用的是IPG水平等點聚焦， Amersham Biosciences 公司的 MultiphorII 和 IPGphor系 統，Bio-Rad 公 司 的 PROTEAN IEF Cell 都為水平等點聚焦提供了良好的平臺，是目前雙向電泳首選儀器。IEF 運行程序和參數的設置須根據 pH 範 圍 和 IPG 膠 條 長 度 而 定。另外，由於樣品蛋 白質組成存在差異，IEF運行條件應因樣品而定。聚焦完成後，膠條既可以在中間電壓 500~1 000V下短時間保持，便於隨時進行第二向的平衡，也可以置於-80℃冰箱中進行長期保存。
3 第二向電泳
第二向是十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS - PAGE)，在恆溫下進行，膠條由一向轉移到二向前，要在平衡液中平衡30分鐘，使膠條浸透SDS緩衝液，平衡液使固相pH梯度膠條的pH適合第二向電泳，並防止電內滲，以及提高蛋白質從一向到二向的轉移效率。一般採用 1.5～1mm 厚的聚丙烯醯胺凝膠，進行 5～8 小時左右。起始時用低電流或低電壓 , 樣品在完全走出一向膠條時 , 再加大電流(或電壓)，待指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳，進行染色。目前實驗室最常用的顯色方法是考馬斯亮藍染色和銀染，也有螢光染色，同位素標記，負染法等。
4 圖像分析與鑑定
成像設備可以攝入圖像，對凝膠圖像以數字形式保存，對每塊凝膠圖像進行平等的比較，在各研究組之間傳遞信息，並對大量的數據進行歸類分析。目前應用較為廣泛的圖像分析軟體有PDQuest、ImageMaster 2D Elite、Melanie、BioImage Investigator 等，解析度較高，功能齊全。儘管如此，仍不可避免約10%的未檢出點和假點，需要手工添加、刪除和分割。圖像採集完成後，可以應用各種分析軟體進行分析可以收集、詮釋、比較蛋白質組數據資料等。一旦通過差異分析或其它方法找到感興趣的蛋白後，就可以從凝膠中或膜上切取這些目標蛋白質作鑑定。現在絕大多數蛋白質的鑑定是通過質譜分析來完成的。
雙向電泳的解析度較高，自第一次應用該技術以來，其解析度已從15個蛋白質點發展 到 10000 多個蛋白質點。一般的雙向電泳也能分辨1000～3000個蛋白質點。因此，近年來，雙向電泳被廣泛應用於動物科學、醫學等研究領域。雙向電泳是目前分離複雜蛋白質混合物的最強有力的方法，從很多方面來說，其是最直接尋找和預分離未知蛋白及其翻譯後修飾形式 (post- translationally modified forms , PTMs) 的方法。雙向電泳正是獲得蛋白質整體表達情況的工具，同時還可用於展示基因的差異表達情況。雙向電泳方法與生物質譜技術的不斷進步，以及兩者有效的結合，使研究人員能夠更加有效地分離蛋白質複雜混合物、顯示蛋白質差異以及隨後鑑定這些蛋白質。線粒體或細胞核 (nucleus) 等濃縮的細胞器浸液可通過超速離心等一系列步驟獲得 , 用雙向電泳分析。因此，能在單個實驗中分離多種細胞器特有的蛋白質。但由於生化分離過程尚不夠完善，雙向電泳所呈現的蛋白質並非來自某一種細胞器，可能混雜了其它蛋白。雙向電泳監測蛋白質表達的整體變化，通過對重組蛋白質生成的連續監測，進行生物工程中細胞株生長的質量控制。雙向電泳也可用於檢測藥物對細胞株蛋白質表達的影響。通過密切監測藥物治療後蛋白質表達的變化，可以獲得藥物作用機理、藥物細胞毒性等信息。應用雙向電泳研究簡單生物體的系統已經較完善，有可能推廣使用。簡單有機生物體的基因組複雜性較低，可得到的樣本量不受限制。另外，比較致病菌株和非致病菌株以及測試其藥物反應對科學研究也有重要價值。5 免疫印跡法———Western blot和Far – Western blot根據固定在纖維素膜上的蛋白質仍能結合抗體來特異識別抗原決定簇的原理，臨床上用於患者血清的免疫印跡來發現新的變態反應原，再通過雙向電泳分離分析。雖然目前並非所有蛋白質的量都能達到質譜的檢測範圍，但這種方法闡明了其單個實驗檢測大量磷酸化蛋白質的能力。由於其較高的靈敏性和特異性，即使在蛋白質組學的概念出現之前，免疫印跡法就已得到廣泛的應用。利用Western Blot 和 Far – Western Blot方法，將標記的蛋白、蛋白結構域或多肽與膜雜交，通過螢光等直接標記方法或其它間接方法檢測它們與膜的結合，從中發現的目的蛋白可以再進行質譜分析鑑定。目前許多研究者利用雙向電泳對人體的各種組織、器官、細胞進行了研究，為疾病的診治及了解發病機制提供了新的手段。例如，在腫瘤的研究中，尋找與腫瘤發生、發展和抗藥性有關的蛋白，Wu等利用表面加強雷射解吸電離(surface-enhanced laser desorption／ ionization，SELDI)蛋白晶片技術進行雙向電泳和質譜分析(MS)，鑑定了來自同一患者的兩個頭頸部鱗狀細胞癌細胞系UMSCCIOA和UMS CCIOB中差異表達的蛋白。Srisomsap 等利用雙向電泳研究了甲狀腺組織(包括正常甲狀腺、多結節性甲狀腺腫、彌散性增生、濾泡性腺瘤、濾泡性癌和乳頭狀癌)的蛋白表達模式。對特定蛋白通過 ESI-MS 和蛋白測序進行鑑定。結果發現一個最顯著的蛋白-組織蛋白酶B(CB)，它在不同的甲狀腺疾病中的表達不同。與非腫瘤性甲狀腺疾病相比，這些組織蛋白酶 B 的蛋白點中CB2 和 CB3 在甲狀腺腫瘤中明顯上調。蘇堅採用二維電泳、圖像分析、質譜技術等方法在相同條件下，對二烯丙基二硫(DADS)處理前後SW480細胞兩種樣品的總蛋白質進行雙向電泳，其中167個匹配的蛋白質點存在表達量上的差異。與對照組相比，處理組蛋白質表達量下調的有 69 個，利用基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜技術(MALDITOF-MS)對其中8個表達明顯下調的蛋白質斑點進行分析鑑定，獲得相應的肽質量指紋圖譜(PMF)，通過資料庫搜索，確定了這8個蛋白，這些差異蛋白質涉及細胞周期調控、細胞分化、細胞凋亡及細胞分裂增殖等眾多事件。因此說明，DADS 可能具有抑制結腸癌細胞生長，阻滯細胞周期，誘導細胞分化及凋亡的作用。利用雙向電泳技術建立和優化了人血清蛋白質圖譜，為進一步開展疾病的血清蛋白質組學研究奠定基礎。另外雙向電泳還應用在臨床診斷、理研究、藥物篩選、新藥開發、食品檢測、甚至物種鑑定等方面。
目前，雙向電泳技術檢測的蛋白質數目比估計的細胞內總蛋白少得多，主要原因有: 一些低拷貝數蛋白由於電泳的靈敏度不夠得不到檢測，實驗結果表明當蛋白質的拷貝數低於 1000時，雙向電泳技術是不能分辨出來的；部分蛋白(如膜蛋白)不溶於樣品緩衝液，疏水膜蛋白和大分子蛋白不易進入凝膠的第二向；一些分子量過大、極端酸性或鹼性的蛋白在電泳過程中會丟失；有時一個蛋白質點含有不止一種蛋白。樣品處理也是影響雙向電泳靈敏度的主要原因之一。雙向電泳在進行蛋白質分離時，其自動化不強，是一項比較費時的工作。雙向電泳所能研究的蛋白質數量和類型還受到很大程度的限制。這為雙向電泳的研究提出了相當大的挑戰。雙向電泳技術具有極高的解析度和靈敏度，可以同時顯示組織或細胞內各種蛋白，但其重複性卻很不理想。高解析度確保蛋白質最大程度的分離，高重複性有利於凝膠間的對比。因此，提高雙向電泳的解析度和可重複性成為人們一直關注的焦點。目前，解決此問題的措施主要有使用商品化的IPG幹膠條，應用窄範圍IPG膠條，減少凝膠厚度，增大凝膠面積(30～40cm)，蛋白質組、重疊群 (proteomic contig) 方法都可以提高雙向電泳的解析度。還有另外一些方面也得到了改善：IPG 膠條的產生；IPGhor等相關系統的產生使得IEF 過程自動化；半自動銀染設備使得同時可以進行多塊膠的染色；電泳後一步進行蛋白質螢光染色；內標的引入簡化了膠的比對過程；有更好的計算機算法硬體設備用於圖像分析。目前雙向電泳技術尚未完善，手工操作較多，經驗性強，且存在許多局限性。儘管如此，該技術目前仍然是蛋白質組研究中不可替代的分離方法，隨著蛋白質組學的興起，對技術有了新的要求和挑戰。近年來，雙向電泳凝膠圖像分析軟體正向高解析度、高靈敏度、自動化、智能化的方面發展，這將對整個蛋白組學的研究起到積極的推動作用。
雙向電泳作為蛋白組學研究的必要工具之一，該技術已被廣泛應用到研究細胞生物學、神經生物學等各種學科領域，其研究對象覆蓋了原核微生物、真核微生物植物和動物等範圍。目前，蛋白質組研究已涉及多種重要生物學現象，信號轉導、磷酸化蛋白、細胞分化、蛋白質摺疊、細胞內蛋白質相互作用。
吉康醫學的雙向電泳技術平臺，為基因調控機制的分析、細胞分化與發育分析、腫瘤的發生與發展，醫藥靶分子的尋找與分析等方面提供強大的支撐。我們將與您共同攜手，輕鬆解決您的研究問題！