「蛋白晶片法or質譜法」蛋白質組學研究方法的選擇及比較

2020-09-03 小析姐

抗體晶片（antibody array）和質譜（MS）是兩種適用於蛋白質組學研究的流行工具。經常會有人將兩種方法進行比較，科學上很難有一勞永逸的方法，每一種方法都有其優勢和局限，有各自的用武之地。那麼，研究蛋白質組學應該如何選擇更合適的研究方法呢？以下將從六個主要方面進行比較和推薦。

近年來，高通量技術平臺的開發大大推動了蛋白質組學研究工作。這些適用於蛋白質分析和標誌物開發的平臺讓研究人員能夠在單次分析中檢測數千種蛋白質。不過，您可能又會面臨甜蜜的負擔，不知道應該選擇哪個平臺。

在此，我們將介紹兩種適用於蛋白質組學研究的流行工具：抗體晶片（antibody array）和質譜（MS）。這兩種方法可以單獨使用，它們產生的數據可以是定性的、半定量的或定量的；也可結合使用，以提高蛋白質組的覆蓋度。當然，具體使用哪種工具要取決於您想回答的問題。

抗體晶片

抗體晶片利用固定在固態基質（比如硝酸纖維素膜、載玻片或微珠）上的抗體來捕獲樣品中特定的蛋白質靶點。之後，利用標記的檢測抗體來確認前面兩者的結合，反應所產生的信號與捕獲的分析物的量成正比。

蛋白質的鑑定過程也很簡單。對於抗體晶片，利用spot的位置可判斷蛋白質。至於CBA（流式細胞微球晶片），根據微珠的顏色可以鑑定蛋白質。這些技術的主要優勢在於憑藉出色的抗體靈敏度，它們能夠檢測低豐度的蛋白質。不過，前提是市場上有經過驗證的抗體，並且與抗體晶片平臺兼容。

目前，RayBiotech、R&D Systems（Bio-Techne）、CST、BD、Abcam等多家公司提供抗體晶片。若想篩選儘可能多的蛋白質，不妨選擇抗體數量多的晶片，比如RayBiotech的Human L2000 Array包含多達2,000個抗體；若想聚集某一條特定通路，則可以選擇相應的產品。

質譜分析

液相色譜串聯質譜（LC-MS）是蛋白質組學研究中最常用到的形式。它首先將蛋白質變性、還原、烷基化和消化，然後對產生的肽段進行分離和離子化。之後根據其質量和片段將每個帶電荷的肽段分配給蛋白質。一次質譜分析可鑑定出5,000多種蛋白質，具體取決於上遊樣本製備和基質。

質譜分析的局限性在於，高豐度的蛋白質可能通過離子抑制而掩蓋低豐度蛋白的檢測。因此，人們有必要事先去除高豐度蛋白，或富集低豐度蛋白。不過，質譜分析是「無假設的」，因為它不依賴於抗體進行檢測，也就無需假設哪些蛋白質是關注的重點。

兩種方法的比較

一些人認為，質譜是研究蛋白質組學的經典方法，所以，一說起研究蛋白質，張口閉口都是質譜，調查發現，其實很多人對質譜的了解也是非常片面、有限的，更多的也是互相之間口口相傳。而對於研究蛋白質組學的另一個卓越的方法蛋白晶片的認識，則多數停留在十幾二十年前的水平，普遍認為這種方法在原理上並不複雜但在技術上還是挺難實現的，所以，有人做到了就顯得不太正常，竟然不太相信過去十多年這個行業突飛猛進的發展。

好吧，此處不加評論，還是讓我們言歸正傳。其實，正如世上沒有包治百病的良藥一樣，科學上也很難有一勞永逸的方法，每一種方法都有其優勢和局限，有各自的用武之地。那麼，研究蛋白質組學應該如何選擇更合適的研究方法呢？以下將從六個主要方面進行比較和推薦。

ROUND 1

篩查蛋白組學表達差異

建議選擇：1000個因子的晶片+質譜

1、不同的方法學有不同的特點：對於質譜，可以篩查到未知的蛋白，但是對於分子量大、低豐度的蛋白質，質 譜的靈敏度和準確性有一定的限制。

2、不同的方法能篩查到的目標不同：根據Proteome Analysis of Human Aqueous Humor

一文中報導，質譜篩查到的差異蛋白集中在小分子與代謝物。而用晶片篩查到的結果，多是集中在細胞因子、趨化、血管、生長等等。

3、質譜篩查到355個蛋白，而R抗體晶片也篩查到328個蛋白，且用定量晶片驗證25個蛋白有差異，這些蛋白是質譜找不到的。目前夾心法抗體晶片已經可以檢測到1000個蛋白，採用雙抗夾心法，尤其是對於低豐度蛋白，有很好的靈敏度和特異性，很多的低豐度蛋白是抗體晶片可以檢測出來，而質譜檢測不到的，且樣品不經過變性和前處理，保持天然狀態的樣品直接檢測，對於蛋白的檢測準確度高。

4、質譜的重複性一直是質譜工作者糾結的問題，不同操作者的結果，不同樣品處理條件，峰值的偏移等影響因素都會產生大的影響；夾心法晶片重複性高。

5、質譜一次實驗可以測定8個樣品；抗體晶片一次實驗可以測定2—1600例樣品甚至更多。

ROUND 2

盲篩驗證和一定研究範圍的篩查差異蛋白

建議選擇：抗體晶片

RayBiotech抗體晶片主要包含：炎症、趨化、凋亡、生長、血管、受體、自身抗體、神經疾病、免疫性疾病、粘附，腫瘤，幹細胞、肥胖、骨代謝、胰島素類，白介素TH類、Ig分型，基質金屬蛋白酶，膿毒症，熱休克等晶片。如果盲篩過後小範圍驗證以及根據自己的研究方向確定的篩查範圍，可以從多種晶片中選擇。

ROUND 3

實驗樣品

建議選擇：抗體晶片

如果樣品是血清血漿，選擇抗體晶片更適合，因為質譜界向來對於血清的檢測效果不看好，血清的成分複雜尤其是50%以上是白蛋白，還有大量的免疫球蛋白、纖維蛋白原，凝血因子和補體，佔血清總蛋白的99%以上，剩餘1%的低豐度蛋白的質譜檢測效果很難達優。

ROUND 4

蛋白定量

建議選擇：抗體晶片

質譜的特點是定性和半定量，如果定量，也是針對感興趣的靶標定量，並不是所有蛋白都可以定量。所以目前基於雙抗夾心法的定量可達1000種蛋白精準定量，所以篩查和定量同時進行的話，抗體晶片有絕對的優勢。

ROUND 5

特殊種屬

建議選擇：抗體晶片+質譜

對於一些特殊種屬，建議用抗體晶片+質譜，綜合兩種方法最大的篩選範疇，一些種屬質譜資料庫也不全，可用的信息有限，所以結合多種方法做檢測效果更佳。

ROUND 6

醫學轉化和臨床應用

建議選擇：抗體晶片

如果初步用了質譜進行盲篩，後續進行小範圍的驗證，用定量抗體晶片或者ELISA，如果想用於臨床，用質譜找到的全新蛋白比較困難且需要後續開發很多相關試劑花費大量時間能完成。如果想要儘快完成醫學轉化和臨床應用，還是要在有現成抗體對的差異因子中篩查。RayBiotech目前是全世界上配對抗體最多的公司，客戶直接用最高通路晶片篩查，後續對應的Elisa都是現成配套的。


（內容來源：生物通 豐信科技 由小析姐整理編輯）

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