釀酒酵母是功能強大的模型物種，可用於系統性的生物學篩選和大規模蛋白質組學方法開發。隨著質譜技術的進步，酵母的全蛋白質組覆蓋幾乎完成。然而，對酵母蛋白質組進行快速高通量分析仍然具有挑戰性。
2020年11月著名蛋白質組學領軍人物德國馬普生物化學研究所Matthias Mann教授聯合Brenda A. Schulman教授和Christine R. Langlois教授共同在PNAS（IF 9.412）雜誌上發表題目為 《DIA-based systems biology approach unveils E3 ubiquitin ligase-dependent responses to a metabolic shift》的研究成果，介紹了一種快速高深度DIA蛋白質組檢測技術，實現酵母全蛋白質組的超高覆蓋度。利用此技術既可以全面表徵酵母蛋白質組響應環境擾動的變化，又可以精確識別單個缺失或點突變對整個蛋白質組的影響。
研究材料：釀酒酵母細胞（Saccharomyces cerevisiae）
技術方法：快速高深度DIA蛋白質組+轉錄組
實驗路線圖：
研究結果：
1、快速高深度DIA檢測技術方法開發
研究者在Orbitrap質譜儀上對DIA整體流程進行了探索。為了生成酵母的綜合圖譜庫，研究者在各種生長和脅迫條件下培養酵母細胞，經提取消化後，通過反相（RP）色譜法將每種條件下獲得的肽段分為8個餾分。使用DDA方法以23min的液相梯度檢測64個餾分（8個餾分×8個條件），通過Spectronaut軟體建立酵母DIA library（74,103條肽段，4712個蛋白，覆蓋酵母全蛋白組的87%；中值序列覆蓋率為27％，每個蛋白質平均檢測到12個肽）。基於此library，23min DIA檢測（六次重複）平均可鑑定到33,909個肽段，3,413個蛋白，這與180min DDA檢測結果相近（33,425個肽段和3,435個蛋白）。
2、技術能力測評一：不同處理條件下酵母大規模蛋白組學分析
研究者對不同處理條件下（不同培養基，熱脅迫，滲透壓脅迫，碳飢餓，胺基酸飢餓和氮飢餓等）的酵母進行大規模蛋白組學分析，共定量到3,506種蛋白質；數量統計發現在所有組別中檢測到的蛋白超過90％的定量一致。
功能分析發現每種處理都會引發不同的響應，造成不同蛋白的合成與降解，這些變化結果與預期調控變化一致。這也證明研究者開發的這種快速高深度DIA方法可以準確定量已知差異蛋白，為酵母研究人員提供了近乎全面的數據資源。
3、技術能力測評二：挖掘GID E3連接酶的調控新機制
研究者進一步探索葡萄糖飢餓及恢復過程中酵母蛋白組學變化，檢測結果共定量到3,602種蛋白質。通過與轉錄組學數據比較，發現在轉變過程中酵母細胞首先通過基因快速轉錄，產生新蛋白質，然後降解不再需要的蛋白。深入分析後發現GID E3連接酶的Gid4亞基受到碳源調控，後續通過對Gid4突變體和Gid2K365A突變體酵母的葡萄糖飢餓前後蛋白組學檢測證實GID E3連接酶具有碳源依賴性的調節功能。研究者最後通過蛋白組學聯合啟動子參考技術（promoter reference technique）發現了GID E3連接酶新的調控靶標：Acs1和Aro10。
小編小結：
本研究建立了一套簡單易行的蛋白質組學分析流程：快速高深度酵母蛋白質組DIA分析技術。它為酵母研究人員提供了近乎全面的數據資源，既可以準確定量已知蛋白差異，又能夠揭示調控新機制。儘管此方法是在酵母中開發的，但該技術的快速，簡便及可擴展性使其適合於任何細胞系統中的檢測，尤其在是缺失或突變體或其他幹擾的機制研究方面，可以獲得更加全面的生物系統響應信息。