Western blot之凝膠電泳

2021-01-14 Azure蛋白印象

在蛋白印跡的第一步中，蛋白在凝膠基質中進行物理分離，這一過程被稱為凝膠電泳（圖1.1）。 將蛋白樣品與上樣緩衝液進行混合，加載到凝膠上，這些蛋白帶有負電荷並向正電極進行移動。

根據使用的凝膠和緩衝體系的類型，蛋白質在凝膠基質中遷移的距離主要由質量:單個蛋白質的電荷比或蛋白質分子量進行分離。

蛋白電泳可以在天然或變性條件下進行（表1.1）。變性條件適合大多數應用，然而，如果需要保留蛋白質的空間結構，則必須使用非變性電泳條件。

圖1.1. 聚丙烯醯胺凝膠電泳


表1.1. 非變性電泳vs變性凝膠電泳


最常用的蛋白質電泳方法是SDS-PAGE凝膠電泳。SDS-PAGE凝膠由pH緩衝溶液，丙烯醯胺和雙丙烯醯胺的混合物（凝膠基質組分）和SDS組成。過硫酸銨（APS）和四甲基乙二胺 （TEMED）用於催化丙烯醯胺單體的聚合，雙丙烯醯胺的加入確保了丙烯醯胺單體鏈的交聯。

凝膠的分辨能力由凝膠的孔徑決定，孔徑由丙烯醯胺的濃度和雙丙烯醯胺交聯劑的濃度共同決定。一般來說，較高比例的凝膠具有較小的孔徑，用於分離分子量較低的蛋白質。較低比例的凝膠具有較大的孔徑，用於分離分子量較大的蛋白。表1.2為不同丙烯醯胺含量凝膠的解析度。

圖1.2. 蛋白質SDS變性的機制


1.2. 不同濃度丙烯醯胺的分辨能力


不連續凝膠（也稱為Laemmli凝膠）是最常用的凝膠系統之一，提供比連續凝膠系統更清晰，更明確的條帶。

不連續凝膠系統由兩層堆疊的凝膠組成，每層凝膠具有不同的丙烯醯胺濃度和pH值，以及與兩種凝膠具有不同pH值的緩衝液。兩種凝膠的pH值和緩衝液之間的不連續性改變了離子的遷移率，特別是兩性離子通過兩種凝膠的遷移率，進而影響蛋白的遷移率。

頂部的凝膠層稱為堆積凝膠或聚焦凝膠。堆積凝膠中丙烯醯胺的含量較低，pH值最低。在典型的甘氨酸緩衝體系中，堆積凝膠的pH值為6.8，緩衝液的pH值為8.3。堆積凝膠的目的是在所有蛋白進入分離膠之前，將它們集中成一個單一的、緊密的條帶。

分離膠，含有丙烯醯胺的百分比濃度較高。在甘氨酸緩衝體系中，典型的分離膠的pH值為8.8 -高於堆積凝膠和緩衝液的pH值。分離膠的目的是根據分子量大小來分離蛋白，因此選擇凝膠的組成(pH，丙烯醯胺的百分比)，以確保蛋白在凝膠中移動。


除了改變凝膠的組成和設置外，改變電泳緩衝體系還可以優化凝膠電泳過程中的蛋白質分離(表1.3)。

 

Azure Biosystems

中國技術示範與服務中心

北京深藍雲生物科技有限公司

網址：http：//www.cycloudbio.com/

電話：010-57256059

E-mail：info@cycloudbio.com

地址：北京亦莊經濟開發區經海四路BOX企業匯25號院2號樓2單元201室

郵編：101111

相關焦點

  • Western blot實驗室實操+原理
    WB流程圖western blot即免疫印跡試驗是一個非常非常重要的實驗技能
  • western blot 過程詳解
    Western Blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。
  • Westernblot實驗步驟及注意事項
    Westernblot 實驗步驟 1. 組織塊稱重 2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊 3.Westernblot 試劑盒顯色 15. 分析比較記錄 western blot的實驗步驟及注意事項的資料 1. 把聚丙烯醯胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上。 1）轉移緩衝液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
  • 淺談Western blot
    Western blot（蛋白印跡）是科研研究中最為平常的實驗，但卻蘊含了很多知識。儘管我們在接觸該實驗時都會被虐的體無完膚，但卻秉承著「WB虐我千百遍，我卻待它如初戀」的精神一直和WB鬥智鬥勇。現在就把各位前輩做WB的各種經驗總結起來，希望對大家能有所幫助。
  • 獻給初學者:western blot 操作步驟詳解
    ，編輯了這份 western blot 操作步驟，內容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細節，並附上參考文獻。電泳電泳槽內加入電泳緩衝液衝洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯醯胺，網上有資料建議低電壓短時間的預電泳，清除凝膠內的雜質，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通，但是在《分子克隆》上卻反對這種做法，理由是會破壞緩衝系統 pH 的不連續性。
  • 獻給初學者:western blot 操作步驟詳解(上)
    ，說法各異，於是綜合了目前網上所能找到的資料和個人實際經驗，編輯了這份 western blot 操作步驟，內容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細節，並附上參考文獻。我按下文的步驟操作已經做出來了穩定可重複的、背景乾淨的 western 條帶了，所以相信你也行。為了節省時間，我總結了一下 western blot Quick Guide和一天做出 western 的具體時間規劃，附在文末，要在下一次展示。
  • 初學者的western blot操作步驟大全
    Western Blot 第1階段：樣品製備Novus Biologicals Visual Protocols: In phase 1 of the western blot procedure, you will learn how to prepare
  • 獻給初學者:western blot 操作步驟詳解(下)
    也可取 10 ml 注射器吸滿轉印緩衝液，往玻璃板與凝膠之間注水，使液體的壓力將兩者自然分開。取出凝膠後應注意分清上下，可以在右上角裁一個小角。之後有兩種方法供選擇，一是按照 marker 指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉膜，前一種方法更加節約材料，但操作稍微麻煩了一點。
  • Western blot 實驗步驟
    該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由於免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用於鑑定某種蛋白，並能對蛋白進行定性和半定量分析。結合化學發光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異；將混合抗原樣品在凝膠板上進行單向或雙向電泳分離, 然後取固定化基質膜與凝膠相貼。
  • Western Blot(WB)蛋白免疫印跡基本原理及FAQ | RIP專題
    免疫印跡（Western Blot） 採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。SDS-PAGE 可對蛋白質樣品進行分離，轉移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質，並保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。
  • Western-blot整個實驗過程中的原理全在這裡
    連續PAGE是指使用相同凝膠濃度（凝膠孔徑）和緩衝系統的電泳，樣品緩衝液、凝膠緩衝液、電泳緩衝液均相同，且pH值恆定。使用連續電泳系統分離蛋白質，由於分子篩效應不明顯，一般只用於分離組分比較簡單的樣品，且沒有濃縮膠的濃縮作用，解析度較低，加樣時必須加成一條極窄的帶，以使樣品能很好地分離。但如果高解析度不是實驗目的，用這種方法制膠快速而簡單。
  • Western Blot (免疫印記法)常識問答
    什麼是western blot?　　答：WB又稱免疫印記法.是將生物大分子物質通過不同途徑轉移到固相載體的過程。　　2. western blot 有什麼優點?　　答：靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便，特異性高。　　3. western blot 的具體步驟是什麼?　　答：一.
  • Western Blot詳解-原理
    原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。
  • Western Blot的原理及步驟
    一、Western Blot的原理Western Blot與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。
  • Western Blot詳解-常見的問題指南(一)
    C.細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？  解答：一般5×10^6就足夠了D.同一樣品能同時提RNA又提蛋白麼？這樣對western blot有無影響？  解答：能，沒有問題，我們做過。
  • Western blot竅門分享
    做了兩年半的Western blot，真的是遇到了太多不可思議的、解決不了的問題，猶記得剛進實驗室的時候，學會了WB像是學會了全世界，殊不知這只是科研實驗的一塊小磚頭，如今快要畢業了，還在每天跑著WB補實驗。今天在這裡跟大家分享一些做WB的小竅門，不一定有科學原理支撐，但卻能讓你節省時間，跑出完好看的條帶。
  • Western Blot試驗
    當預染的Marker告訴你，你要分辨的蛋白已經到達最佳分辨區——分離膠的2/3處，OK，電泳結束了。電泳樣品假如樣品緩衝液後,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質充分結合形成SDS-蛋白質複合物溴酚藍指示劑是一個較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當指示劑到達凝膠底部時,即可停止電泳.
  • Western Blot 一般流程
    上樣與電泳      蛋白抗原上樣量為30 ug。根據樣品量選擇SDS-PAGE電泳玻璃板間隙厚度，一般0.75mm間隙15孔的上樣量 < 15uL/孔，1mm間隙10孔的上樣量 < 30ul/孔。
  • 技術:Western Blot
    其基本原理是將電泳分離後的細胞或組織中蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息，廣泛應用於基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。