分離膠及濃縮膠均可事先配好(除AP及TEMED外)，過濾後作為儲存液避光存放於4 ℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡(否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解於儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘)，加入10%AP(0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100)及TEMED(分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000)
PAGE配膠的試劑和配方比例對電泳結果的質量當然有決定性的影響，這個配膠的比例，在《分子克隆》上有詳細的論述，相信大家都不難查到。容易忽視的問題主要在於過硫酸銨(AP)一定要新鮮——最好用小指管配AP(寫日期)保存在-20度，超過2周的AP扔掉算了，或者已經反覆打開使用多次的AP都別用，
灌入2/3的分離膠後應立即封膠，膠濃度<10%時可用0.1%的SDS封，濃度>10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠後切記，勿動。
如用醇封膠需用大量清水及ddH2O衝洗乾淨，然後加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴
10%的AP最好現配現用，如在4 ℃存放勿超過兩周。30%的丙烯醯胺如有沉澱，最好棄掉
過硫酸銨(APS)(10%;w/v)
取3 g過硫酸銨，溶於去離子水，至終體積為30 mL。此溶液4 ℃下在短暫的數日內是穩定的，但建議，對每一組新膠均應新鮮配製
但搖動溶液時不要過於劇烈以免引入過多地氧氣。
二、樣品處理
先製備蛋白樣品，後灌注壓縮膠，壓縮膠灌注後應在20~40 min內使用。
上樣前蛋白樣品最好離心，上樣量不宜過多，以免看結果時，每個條帶都彎彎地「笑」你貪多嚼不爛哦。其他的操作，按照說明控制電流，不要過多重複使用電泳Buffer(別小氣，重複使用會降低緩衝能力的)，好像基本不會出問題了。當預染的Marker告訴你，你要分辨的蛋白已經到達最佳分辨區——分離膠的2/3處，OK，電泳結束了。
電泳樣品假如樣品緩衝液後,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質充分結合形成SDS-蛋白質複合物
溴酚藍指示劑是一個較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當指示劑到達凝膠底部時,即可停止電泳. 另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.
樣品製備是關鍵步驟，要求儘可能的獲得所有蛋白質，應注意以下問題：
1. 在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重複性。
2. 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質複合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。
3. 儘量去除核酸，多糖，脂類等幹擾分子。
4. 防止蛋白質在樣品處理過程中的人為的修飾，製備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾(建議加入合適的蛋白酶抑制劑) 5：樣品建議分裝成合適的量，然後冷凍乾燥或直接以液體狀態置-80 ℃中保存，但要注意不要反覆凍融。
三、電泳
所有蛋白樣品調至等濃度後上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1×loading buffer上樣，Marker也用1×loading buffer調整至與樣品等體積
低電壓短時間的預電泳(恆壓10-20 V,20-30min)，清除凝膠內的雜質，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通
以初始電壓為45 V時的電流強度進行穩流電泳，當電壓達65V時改為穩壓電泳
注意加樣時間要儘量短，以免樣品擴散，為避免邊緣效應，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩衝液
凝膠上所加電壓為8 V/cm。當染料前沿進入分離膠後，把電壓提高到15 V/cm，
四、轉膜
由於轉膜過程中的氣泡問題對於實驗結果有很大的影響
切記：每層之間用滴管將其中的氣泡全部趕出，決不允許氣泡存在。
將PVDF膜先在甲醇中浸泡幾分鐘,再轉移到轉膜緩衝液中處理15min。
PVDF膜，125-200 ug/cm2(適合於SDS存在下與蛋白質的結合)
另外提醒一句：由於NC膜上結合的蛋白會因為一些去汙劑而被代替，因此在封閉時最好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%(據說0.05%效果最好)
PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預處理(不超過15秒)再用緩衝液平衡，才能用
如果WB前沒有可參考的資料——比如不知道是否有表達，比如抗體少還要摸條件(稀釋度)，可以用剪膜剩下的邊角料來先做幾組點雜交摸條件，省點時間省點試劑;
切個小角是常用的方法。膜上要做好標記，識別正反面和上下
膜徹底浸潤後顏色會變深一點，任何白點或者斑都是沒有完全浸潤的標誌，會影響轉膜的
半乾電轉移要防止過熱
轉膜後，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限於封閉做的好不好
切記。封閉時間和封閉劑的量都要足夠。封閉不完全，後面就全白忙活了
五、封閉及雜交
可以遵從以下原則：單抗專一性高，但是經過SDS-PAGE變性膠電泳的蛋白質可能由於原來的識別位點構象發生改變而不被識別，多抗不如單抗專一性高但更容易得到結果。
一抗的稀釋度通常需要預實驗摸條件，可以根據說明書上建議的WB稀釋度附近做2—3個梯度，如果是用化學發光法檢測，由於靈敏度高而建議將稀釋度再放大一些
反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加於搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸乾，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4 ℃靜置過夜。在反應體系外面罩一溼潤平皿以防止液體過多蒸發。
封閉液與抗體溶劑均為含5%脫脂奶粉的PBST或TTBS，臨用時取200 ml PBST或 TTBS加入10 g脫脂奶粉即為封閉液。
一抗溶液中加入0.2% 疊氮鈉後可4 ℃存放至少2周(一個月我也用過，沒問題，再長時間還沒試
六、發光鑑定
一般的WB檢測過程中，都會有封閉、一抗、二抗和底物顯色這四道工序要「加工」。我個人覺得底物顯色這最後一步是最關鍵的，也是最有文章可以作的一個部分
化學發光Chemiluminescent和底物顯色Colormetirc/Chromogen，前者靈敏度很高——隨著各大廠家努力開發研製靈敏度更高的發光底物，化學發光法的靈敏度已經達到pg級別，甚至還有 Femto級別的，靈敏度超過了同位素;而後者由於直接顯色而操作簡便且成本低。最為大家熟悉當數辣根過氧化物酶HRP(Horseradish Peroxidase，屬於過氧化物酶POD類)和鹼性磷酸酶AP(Alkaline Phosphatase)
最熟悉的底物應該是二氨基聯苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性產物，靈敏度高，特異性好，缺點就是需要現配現用，顯色後光照數小時會褪色，不能永久保存，需要拍照記錄，而且有毒。DAB的選擇有一點小小的技巧——二氨基聯苯胺4鹽酸鹽的純品分子量為360.1，通常是深棕色粉末，不太好溶於水，容易得到有色顆粒的溶液而導致膜上的背景，而且價格還被炒得貴;但是如果選擇2水合二氨基聯苯胺4鹽酸鹽(分子量396.14)就是白色粉末狀晶體，易溶，溶液無色均勻，量大價格還便宜。
HRP化學發光反應底物，化學發光法由於僅在酶和底物都存在的時候才會發光，不同於生色反應般形成不溶的產物於膜上累積，所以特別適合同一張膜對不同的目標蛋白分別進行多次檢測。
分子克隆III推薦的AP適用封閉劑是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10 mmo lEDTA 65度加熱一小時確保AP失活後再用於封閉。
所以選擇正確的蛋白Marker也是Wb實驗成功的必要條件之一。
在選擇上來說，當然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。
多次反覆凍融對於蛋白的危險，不用多說吧。
這種預染蛋白分子量標準可以幫助我們在電泳時、電泳後，以及轉膜後監測電泳情況和估計遷移率
真的有這樣一種產品，抽掉了WB中費時的非必需步驟——轉膜和封閉，直接在PAGE電泳膠上做免疫印跡!這個幾乎顛覆傳統WesternBlot概念的技術創新，完美演繹了「沒有做不到，只有想不到」這一句話。
注意事項：
1. 免疫印跡雜交的敏感與檢測系統有關.因此,凝膠電泳時的蛋白上樣量應該保證被檢測抗原量不至於太低,如果過低應該重新純化和濃縮使用,或者建議做一次剃度稀釋,上樣電泳後,直接考馬斯亮藍染色選擇最佳上樣量,純化和濃縮的蛋白質樣品必須注意鹽的濃度過高,可平衡一下鹽的濃度,如,透析.
2. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度,激活劑的濃度適當,不僅可以決定凝膠聚合的速度,也將影響凝膠的質量,聚膠時的溫度也將影響凝膠聚合的速度.因此,建議要根據不同溫度下適量增減激活劑的用量以保證分離膠從加入激活劑起至開始出現凝膠凝聚的時間為15-20分鐘最佳,對於濃縮膠最佳聚合時間為8-10分鐘開始可見聚合.灌完分離膠加水封閉分離膠與外界氧氣的結合.
3. 未聚合的丙烯醯胺具有神經毒性,操作時應該戴手套防護.梳子插入濃縮膠時,應確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產生,梳子拔出來時應該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠內.
4. 電泳槽內加入電泳緩衝液衝洗清除黏附在凝膠底部的旗袍和未聚合的丙烯醯胺,同時建議低電壓短時間的預電泳,清除凝膠內的雜質,疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通(恆壓10-20 V,20-30min)
5. 加樣前樣品應先離心,尤其是長時間放置的樣品,以減少蛋白質帶的拖尾現象
6. 為避免邊緣效應,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩衝液
7. 樣品緩衝液中煮沸的樣品可在-20℃存放數,,但是反覆凍融會使蛋白質降解
8. 為減少蛋白質條帶的擴散,上樣後應儘快進行電泳,電泳結束後也應直接或者轉印.
9. 上樣時,小心不要使樣品溢出而汙染相臨加樣孔
10. 取出凝膠後應注意分清上下,可用刀片切去凝膠的一角作為標記(如左上角)轉膜時也應用同樣的方法對NC膜做上標記(如左上角)以分清正反面和上下關係.
11. 轉膜時應依次放好NC膜與凝膠所對應的電極,即凝膠對應負極,NC膜對應正極
Western Blot原理寶典
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。
1. 我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜後染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什麼辦法可以解決?
解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，多加5-10%甲醇
2. 有什麼方法可以提高上樣量?
解答：可以濃縮樣品;增大上樣體積來增大上樣量。
3. 一抗，二抗的比例是否重要?
解答：比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底
4. 在做Western Blot時，PBDF膜用甲醇浸泡的目的?
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的
影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素：
1. 電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。
2. 膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要乾淨，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。
3. 一般電泳是積層膠60-80 v，分離膠100 v
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