PNAS:人誘導性多功能幹細胞揭示一種馬凡綜合症病因

ELISA檢測表明與正常人iPSCs相比，馬凡綜合症病人來源的iPSCs中TGF-β信號傳導活性增強

美國史丹福大學醫學院研究人員證實被視為人胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ESCs)替代選擇的誘導性多功能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)能夠像ESCs一樣真實反映基因疾病---比如馬凡綜合症(Marfan syndrome)---的確定缺陷。2011年12月12日，該研究在線發表在《美國國家科學研究院學報》(Proceedings of the National Academy of Sciences)雜誌上。這項研究的立即影響就是人們將能夠從個人層面利用iPSCs在分子水平上研究馬凡綜合症。另一方面，ESCs由於它們的遺傳物質來自捐獻者的胚胎不是來自病人自己的胚胎，所以不能做同樣事情。

利用iPSCs為很多種人類疾病構建模型的前景是激動人心的，贏得一些人的廣泛讚揚，但同時又遭遇其他人投射來的敏銳眼光。因此關於iPSCs應用的原理證明也是更加有普遍意義的，因這樣能提高iPSCs的可信性。不同於ESCs，iPSCs幾乎能夠從任何人身上輕鬆獲得，而且擁有與它們來源的病人相同的遺傳背景。再者，它們因為不需破壞胚胎而不會產生倫理爭議。

這篇研究的通訊作者Michael Longaker教授說，「我們的體內研究發現的內在機制可能能夠用來解釋馬凡綜合症的臨床表徵。」

馬凡綜合症是一種遺傳性結締組織疾病，發病機率為一萬分之一到兩萬分之一。它是由於一個基因存在的大量缺陷之中任何一個缺陷導致的。患有這種疾病的人們往往非常高大和消瘦，而且往往遭受骨質疏鬆症的折磨。醫學專家們推測美國第16任總統亞伯拉罕-林肯(Abraham Lincoln)也患有這種疾病。馬凡綜合症也能夠深深地影響眼睛和心血管系統。

在這項研究中，iPSCs和ESCs都攜帶一種導致馬凡綜合症的基因突變，兩者都表現出受損的骨組織形成能力，而且都很容易形成軟骨。這些異常都反映出該疾病最為顯著的臨床表徵。

誘導性多功能幹細胞，或者說iPSCs，是2006年發現的，是從完全分化的諸如皮膚之類組織獲得的。然而，在器皿中，它們具有ESCs同樣的分化為身體所有組織和無限繁殖的能力。因為iPSCs提供一種沒有倫理上擔憂的胚胎幹細胞替代選擇，它們點燃了人們的希望：基於科學家們一直努力在器皿上分析根本上造成從糖尿病到帕金森疾病等各種疾病甚至非常複雜的諸如心血管病和自閉症之類疾病的細胞缺陷，它們能夠在這方面替代ESCs。

對iPSCs而言，一種希望就是能夠在器皿上將它們分化為感興趣的組織---比如說，帕金森疾病或自閉症病人的神經細胞---然後去觀察和研究這些細胞的特徵從而能夠以一種病人特異性的方式理解這種疾病。這對於ESCs而言幾乎是不可能的，除非來自捐獻的人卵來源的ESCs能夠被修飾，即將病人自己的遺傳物質替換性置入這些卵中從而反映病人自己的遺傳背景，但是迄今為止這種方法是難以實現的。

儘管科學家們為利用這些細胞設置的目標遠不只是用於研究目的---開發再生醫學方面的治療應用---，但是前景是極其暗淡的。科學家們將首先不得不開發出方法以便能夠在這些細胞(不論是iPSCs還是ESCs)內部修復造成病人疾病的基因缺陷，然後將這些細胞大量分化以便替換受影響的組織，從而可能在再生醫學上進行應用。再者，從理論上講，iPSCs更加值得試一下，因為它們最初是從特定病人身上獲得的，它們能夠分化產生的組織更加不可能產生宿主移植排斥，而利用宿主胚胎ESCs產生的類似組織則很可能激起宿主移植排斥。

然而，大量研究報導iPSCs和ESCs之間存在微妙的差別，意味著這兩者可能不是等價的。 Longaker說，專家們一直想知道這些差別是否可能使得iPSCs在構建疾病狀態模型上是不能足夠替換ESCs的。

當史丹福大學生育和生殖醫學中心主任Barry Behr，一名產科與婦科教授，開展胚胎植入前基因診斷以便鑑定出適合體外受精的胚胎時，一種能夠直接比較ESCs和iPSCs的機會在機緣巧合中產生了。Behr和史丹福大學生殖和幹細胞生物學中心主任Renee Reijo Pera (一名婦科教授)都是該研究論文的共同作者，他們發現一種候選胚胎攜帶一種導致馬凡綜合症的基因突變。這種胚胎因而被視為不適合進行植入。但是它是攜帶導致馬凡綜合症的基因突變的胚胎幹細胞的一個潛在來源。因此，研究人員不是丟棄或儲存它，而是在得到許可後獲得Longaker研究小組用於研究的胚胎幹細胞。

隨後就是就是全明星級研究人員合作開展研究，他們包括史丹福大學醫學院幾個部門的高級職員和義大利那不勒斯費德瑞科二世大學(University of Naples Federico II)研究人員。這些研究人員從這種攜帶導致馬凡綜合症的基因突變的胚胎中獲得ESCs。他們也從另一名來自史丹福大學的論文共同作者Uta Francke博士(一名遺傳學和兒科教授)那兒獲得馬凡綜合症病人皮膚活組織樣品，通過現在常規的實驗方法將這些樣品中的成纖維細胞重編程為iPSCs。

Longaker說，「我們將iPSCs和ESCs一起放在培養器皿上，兩者都含有導致馬凡綜合症的缺陷基因。這是一個直接比較它們的絕佳機會。」

當他們這樣做時，Longake、論文第一作者Natalina Quarto博士和他們的助理發現從馬凡綜合症綜合症病人皮膚獲得的iPSCs和從攜帶導致馬凡綜合症的基因突變的胚胎中獲得的ESCs都表現出與觀察到的該疾病骨骼症狀異常特徵一樣的特點---骨組織形成能力下降，相反更加容易形成軟骨。

這些科學家們開始研究時就知道導致馬凡綜合症的基因突變位於編碼蛋白FIBRILLIN-1的基因中。重要的是，已知FIBRILLIN-1反過來會抑制細胞間信號傳導分子TGF-β的活性。小鼠研究已表明FIBRILLIN-1缺失或者發生突變導致它不能產生這種抑制作用。這篇研究第一次在人身上證實幹細胞不能形成骨組織而是大量產生軟骨直接原因是它們要比正常的人細胞接觸到更多和活性更強的TGF-β。

iPSCs能夠完全忠實地重複ESCs開展實驗時觀察到的馬凡綜合症細胞和分子缺陷，確實可能允許iPSCs用於研究，而且長期而言，甚至可以逐個病例的方式治療疾病。儘管馬凡綜合症是一種單基因疾病，但是它能夠和確實由一個基因的大量突變---迄今為止已鑑定出600多種突變---中任何一個突變導致，這就表明不同病人在症狀上存在著一些微妙差異。(生物谷：towersimper編譯)

Skeletogenic phenotype of human Marfan embryonic stem cells faithfully phenocopied by patient-specific induced-pluripotent stem cells

Natalina Quarto, Brian Leonard, Shuli Li, Melanie Marchand, Erica Anderson, Barry Behr, Uta Francke, Renee Reijo-Pera, Eric Chiao, and Michael T. Longaker

Marfan syndrome (MFS) is a heritable connective tissue disorder caused by mutations in the gene coding for FIBRILLIN-1 (FBN1), an extracellular matrix protein. MFS is inherited as an autosomal dominant trait and displays major manifestations in the ocular, skeletal, and cardiovascular systems. Here we report molecular and phenotypic profiles of skeletogenesis in tissues differentiated from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells that carry a heritable mutation in FBN1. We demonstrate that, as a biological consequence of the activation of TGF-β signaling, osteogenic differentiation of embryonic stem cells with a FBN1 mutation is inhibited; osteogenesis is rescued by inhibition of TGF-β signaling. In contrast, chondrogenesis is not perturbated and occurs in a TGF-β cell-autonomous fashion. Importantly, skeletal phenotypes observed in human embryonic stem cells carrying the monogenic FBN1 mutation (MFS cells) are faithfully phenocopied by cells differentiated from induced pluripotent-stem cells derived independently from MFS patient fibroblasts. Results indicate a unique phenotype uncovered by examination of mutant pluripotent stem cells and further demonstrate the faithful alignment of phenotypes in differentiated cells obtained from both human embryonic stem cells and induced pluripotent-stem cells, providing complementary and powerful tools to gain further insights into human molecular pathogenesis, especially of MFS.