本文來源於藥明康德微信公眾號（ID：WuXi
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近日，一篇討論腫瘤免疫療法的文章引起了許多行業人士的關注。這篇文章發表於「腫瘤免疫療法研究趨勢」網站，作者是楊森製藥（Janssen Pharmaceutical Companies）的腫瘤
免疫學家Nataša Obermajer博士。在這篇文章裡，作者深度討論了兩類使T細胞靶向
腫瘤的方法——嵌合抗原受體（CAR）與雙特異性抗體（BsAb）。在今天的報導裡，藥明康德微信團隊也將為各位讀者整理這篇文章的核心內容。
前言
在最新一代的腫瘤免疫療法中，科學家們將目光投向了T細胞。利用這些細胞的腫瘤殺傷能力，我們有望設計出全新的抗癌療法。在過去的幾年裡，CAR-T細胞療法與雙特異性抗體療法使T細胞能有效地靶向CD19等抗原，為罹患B細胞惡性癌症的患者帶來了極好的緩解，也為
腫瘤免疫療法領域帶來了革新。
儘管這些創新療法帶來了積極的臨床效果，但它們面臨著類似的問題：在血液癌症中，它們有潛在的毒性風險。而在實體瘤的治療上，它們的療效還尚未得到證實。為此，我們有必要了解這些療法背後的機理與局限，以及它們在未來的應用潛力。
嵌合抗原受體（CAR）
CAR是指一類人工合成的受體，它包括了細胞外的腫瘤抗原識別區域，以及一個用於細胞內信號通路的CD3ζ區域。此外，CAR抗體還會包括1到2個共刺激域。當其單鏈可變片段（scFv）與
腫瘤發生結合後，能激活T細胞受體，從而導致T細胞對表達抗原的細胞產生反應。
去年，美國
FDA批准了兩款CAR-T療法上市，它們分別是
諾華的Kymriah （tisagenlecleucel）與Kite Pharma（已被吉利德收購）的Yescarta（axicabtagene ciloleucel）。這兩款CAR-T療法都靶向致癌性B細胞表面的CD19抗原：前者治療B細胞急性淋巴性
白血病，能取得高達83%的緩解率；後者則在B細胞非霍奇金淋巴瘤的治療中，取得了72%的緩解率。
在這兩款療法之外，還有不少CAR-T療法正在開發之中，它們來自Juno Therapeutics，Celgene，bluebird bio，Mustang Bio，Servier，Pfizer，Cellectis，以及Celyad等生物醫藥公司。不同研發人員開發的CAR-T療法，其CAR結構可以很多樣化，細胞外結構域，跨膜結構域，以及細胞質結構域都能有所區別。
▲CAR分子的一些設計（圖片來源：參考資料[2]）
最近，一些新藥研發人員也正在設計全新的CAR。其中一些CAR-T細胞能特異性靶向腫瘤微環境，以克服腫瘤的免疫抑制效果。舉例來說，IL4R細胞外結構域與IL7R細胞內結構域的融合，可以靶向細胞因子，從而讓T細胞在抑制性細胞因子IL4存在的情況下，依然可以得到激活和增殖；此外，表達趨化因子受體CCR2b的CAR-T細胞也能靶向腫瘤表面高度表達的CCL2；一些CAR能靶向腫瘤血管上過量表達的VEGFR2或αvβ3，增強CAR-T細胞對
腫瘤的穿透能力；還有一些新穎的療法可以將CAR-T細胞作為特定細胞因子或共刺激因子的遞送者，增強內源效應T細胞的浸潤。
雙特異性抗體（BsAb）
在CAR之外，另一個使用單鏈可變片段（scFv）技術的新領域是雙特異性抗體。在上世紀80年代中期，人們造出了首個能將T細胞導向特定抗原的雙特異性抗體。自那以後，雙特異性抗體領域取得了快速的發展。到2017年，這一領域的論文總數已經超過了2500篇。目前，絕大部分的雙特異性抗體是通過DNA重組技術來生成的，而通過化學方法將兩個單克隆抗體進行交聯的技術也在一些研究中證明了其可行性。在這一領域的蓬勃發展下，大量雙特異性抗體正在臨床前和
臨床試驗中驗證它們的潛力。通過將T細胞直接引導至靶向細胞，這些T細胞的激活將不受MHC的限制，也不需要依賴於天然T細胞受體的特異性。
雙特異性抗體的構型有許多種。一些研究表明，針對某些特定的抗原，某種構型可能表現更佳。但通常意義上說，一種結構是不足以滿足所有需求的。這是因為單克隆抗體的互動、抗原上的表位位置、以及抗原在靶向細胞表面的密度與運動性，都會影響到T細胞的激活。
▲一些雙特異性抗體的設計（圖片來源：參考資料[3]）
在諸多雙特異性抗體中，許多研究人員對雙特異性T細胞接頭（BiTEs）有獨特的興趣。這是一類重組的雙特異性蛋白，具有兩個相連的單鏈可變片段，其中一個靶向T細胞表面的分子（如CD3ε），另一個靶向癌細胞表面的抗原。這兩種單鏈可變片段被靈活地連接在一起。
2014年，美國
FDA批准了能夠針對CD19的BiTE分子Blincyto？（blinatumomab），用於費城染色體陰性的復發或難治性B細胞前體急性淋巴性白血病（ALL）的治療。Blinatumomab由VL-VH向的抗CD19單鏈可變片段，與VH-VL向的抗CD3單鏈可變片段，通過G4S連接。由於分子體積較小，這些BiTE的半衰期只有1.25小時。為了克服這一限制，人們正在研究一些新的方法，譬如將BiTE連接到重鏈片段，或是做出其他新的設計，以提高它在血清裡的半衰期。此外，它也能通過連續的輸注治療，確保體內的濃度。
最近，行業對BiTE的體內製造產生了興趣。其一大策略是通過基因改造的T細胞來產生BiTE，這能克服其半衰期較短的問題。另一種方法是使用溶瘤病毒來表達BiTE。與此同時，研究人員們也指出了BiTE的一大挑戰：它的活性取決於
腫瘤部位的T細胞種類和密度。倘若這些T細胞都已經耗竭，或都是調節性T細胞，就會影響到BiTE的效果。
另一種雙特異性抗體——雙鏈抗體（diabody）是由兩條鏈組成的雙價分子，每一條鏈都具有VH和VL結構域。在雙鏈抗體中，兩個可變結構域通過較短的連接子（如G4S）相連。也正是由於這些連接序列較短，雙鏈抗體無法通過鏈內重組形成抗原結合位點。相反，這兩條鏈會以「頭-尾」的方向形成雙聚體，成為一個緊實的分子。如果在同一個細胞內同時表達這兩條鏈，就有望產生雙特異性的異體雙聚體，帶來相應的可變域（VHA-VLB / VHB-VLA，或VLA-VHB / VLB-VHA）。但此類雙鏈抗體的一個潛在問題在於，如果形成同源雙聚體，則無法帶來正確的可變域（VHA / VLB或VHB / VLA）。一個替代做法是在這兩條鏈的C端上，將半胱氨酸共價連結，即雙親性重靶向蛋白（dual-affinity retargeting proteins， DART）。
作用機制中的關鍵
T細胞的亞群：在CAR-T細胞療法中，CD4陽性和CD8陽性的T細胞經常被混在一起進行基因編輯，插入CAR，再被輸注回患者體內。儘管CD8陽性的T細胞被認為是殺傷癌細胞的主力軍，但CD4陽性的T細胞在裝備了CAR之後，同樣能被激活，並顯示出細胞裂解的活性。同樣，在與BiTE分子共同培育時，CD8和CD4陽性的T細胞也都能被激活，誘導靶向
腫瘤細胞的死亡。其中的區別在於CD8陽性的T細胞殺傷速度更快。
T細胞的表型：現在我們知道，分化水平越低的CAR-T細胞，在體內的療效越好。因此，研究人員們期望能儘量產生TSCM（stem memory T cell）與TCM（central memory T cell），並對其保持維持。但在BiTE領域，我們需要不同的T細胞類型。初始T細胞在BiTE的作用下，無法被激活。因此， BiTE介導的細胞毒性，需要和共刺激信號通路無關的T細胞群體參與。
連接的結構域：由BiTE與CAR介導的T細胞-靶向細胞的結合在形式上有所不同。這可能是因為BiTE涉及到了天然的CD3複合體。對於BiTE來說，
腫瘤相關抗原表位與靶向細胞膜之間的距離，決定了它的活性。這可能是不同雙特異性抗體療效產生差異的原因。
T細胞的擴增：CAR-T細胞在擴增後，可達到體內循環淋巴細胞的20%之多。而對於BiTE來說，大量曾接觸過抗原的T細胞能直接加以利用，從而減少了對於細胞擴增的依賴。相比CAR-T細胞動輒擴增1000倍以上，在一些BiTE案例中，T細胞只需擴增2-4倍。這一特性有望讓BiTE在實體
腫瘤的治療上更具優勢。當然，這需要建立在對實體瘤進行良好穿透的前提下。
親和性：最初，人們認為較低的CD3親和性（KD ～ 10 ^ -7M或以上）能避免非特異性的T細胞激活。這是因為高親和性（KD ～ 10 ^ -9M - 10 ^ -8M或以下）的二價CD3結合可能會帶來非靶向特異的T細胞激活。但後續的研究則表明這些非特異的激活可能與抗體的交聯有關，而非二價結合的直接後果。
T細胞療法的未來
作者在文章中指出，在T細胞療法領域，未來主要的幾大策略包括：
通過提供積極的刺激，或是對免疫檢查點進行抑制，增強臨床上的抗
腫瘤效果
尋找到創新的靶點，以克服實體
腫瘤微環境導致的耐受，或是克服惡性血液癌症中由於抗原表達下調而導致的獲得性耐受
尋找到T細胞的新來源，如異體的通用型T細胞療法
精準地調控效應細胞，以限制療法的毒性
先進的CAR工程化技術有望能拓展CAR的結合能力，讓其靶向多種不同的抗原。如果CAR-T細胞能結合兩種抗原，並只有在同時結合的情況下才被激活，則有望為這一療法帶來革新。作者指出，這些細胞能先通過第一代CAR技術結合第一種抗原，產生第一個信號。接著，通過設計一款嵌合的共刺激CAR（只在沒有CD3ζ的情況下發生共刺激），第二款抗原能產生第二個信號。在實體瘤領域，類似的腫瘤相關抗原的「雙靶向」策略有望增強T細胞的選擇性，拓展應用前景。為了確保這種方法能取得成功，我們必須對
腫瘤相關抗原進行仔細的選擇，確保它們在細胞表面存在或表達。
最近的一些新型CAR設計保留了CAR的骨架，但使用了單鏈可變片段之外的結構域。比如有些公司使用的是CD16的細胞外結構域，一些公司開發的T細胞表達有自然殺手細胞的受體（NKG2D），以靶向8種不同的
腫瘤配體。
另一些公司正在嘗試使用不同的T細胞。比如bluebird bio和蘇格蘭的生物技術公司TC Biopharm合作，利用gamma delta T細胞，開發針對實體瘤的CAR-T療法。按設想，這種療法能選擇性地靶向癌細胞，而不會攻擊健康細胞，從而顯著降低毒性。
還有一類新穎的設計是使用藥物分子去激活CAR。在這類設計中，CAR的信號元件被分成了幾大塊。只有在某種藥物存在的前提下，它們才會聚集在一起產生信號。由Cellectis授權給Servier與
輝瑞（Pfizer）的UCART19就具有類似的開關。只有在rapamycin存在的情況下，CAR-T才會被激活。Bellicum Pharmaceuticals的GoCAR-T療法同樣應用了類似的技術，激活它的藥物是rimiducid。
在對T細胞的激活進行調控之外，行業裡的另一個熱點是開發終止CAR-T細胞功能的開關，以限制其短期或長期的毒性。這一般要求在CAR的設計中插入「自殺基因」，以在特殊藥物分子的作用下，特異性地摧毀這些細胞，控制副作用。其中，一些裝有自殺基因的T細胞療法已經進入了
臨床試驗階段，其中一類表達有HSV-TK，一類表達有iCASP9。前者能被ganciclovir激活，「自殺」效果較好，但其免疫原性可能會限制其應用（因為它來自於皰疹病毒的胸苷激酶）；後者則是將突變的FKBP12與caspase 9的催化結構域相融合，它的免疫原性較好。
後記
在本文的最後，作者指出CAR-T細胞療法與雙特異性抗體在不同的
臨床試驗中，各自有其表現出眾的地方。值得一提的是，這兩種療法在作用機制上各有千秋，如果患者無法從一種療法上得到緩解，不代表他們無法從另一種療法上受益。事實上，有兩名患者在接受了blinatumomab的治療後病情復發，但卻在靶向同一抗原的CAR-T療法治療後達到完全緩解。未來，我們需要更加深入地了解兩類療法的優勢，並考慮組合使用的可能。（
生物谷Bioon.com）
參考資料：
[1] Bridging T cells to Tumors： CARs vs BsAb. Retrieved August 9， 2018 from https：//www.immuno-oncologyresearchtrends.com/home/2018/7/21/cancer-re-direction-and-t-cell-therapies-cars-vs-bites-or-tcr-and-immtacs
[2] Zhukovsky et al.， (2016) Bispecific antibodies and CARs： generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection， Current Opinion in Immunology， https：//doi.org/10.1016/j.coi.2016.02.006
[3] Velasquez et al.， (2018) Redirecting T cells to hematological malignancies with bispecific antibodies， Blood， https：//doi.org/10.1182/blood-2017-06-741058