數據重複、造假……誕生四十年的 WB 正遭遇一場「中年危機」

每位科研人都曾經歷過一段 WB 實驗的黑暗歲月：一個個二十出頭的青年被這位「中年大叔」整天按在地上摩擦…

這個噩夢現在回想起來依然膽戰心驚～

這位誕生於上世紀 70 年代的大叔，四十多年來長盛不衰，至今仍然坐在蛋白質研究技術的「頭把交椅」，但他身後從未缺少過批評與質疑。現在他正在遭遇一場「中年危機」——通過 Western Blot 進行半定量分析的準確性和重複性逐漸受到來自學界的質疑。

由於 Western Blot 環節眾多，實驗設計引入的變量或實驗人員無意的操作誤差都影響著結果的有效性，像不同的樣品製備方法、不均一的轉膜效率、抗體的濃度和質量等。更糟糕的是，Western Blot 是造假重災區之一，這也使得主流期刊對文章中 WB 數據的要求越來越高，包括確保可重複性和定量準確性等。

那麼，當面對這樣一張 WB 結果，如何確保條帶間差異真實反應了樣品的生物學變化？

挽救 Western Blot 的「中年危機」

想獲得可靠、線性的定量 Western Blot 數據，高質量的樣品製備和優化的實驗方案必不可少。但即便如此，在實驗流程中也很難完全避免誤差，這時就需要進行歸一化分析（normalization），來讓定量數據更為真實可靠。

歸一化修正了什麼

歸一化是通過將靶蛋白相對於內參對照（Internal loading control）進行定量，以修正實驗中非樣品相關的系統誤差，如所製備樣品濃度不同、泳道間上樣量不同、不均勻的蛋白轉印。在此基礎上，印跡中靶蛋白相對水平的變化才能有效指示樣品間生物學差異。

歸一化策略有哪些

經典常用——管家蛋白歸一化：

基於管家蛋白（Housekeeping Protein，HKP）為內參的歸一化是常用的蛋白印跡歸一化方法，即選取 α-tubulin、β-actin 或 GAPDH 等內源性蛋白作為歸一化的對照。雖然經典，但越來越多的研究表明這種方法存在 bug：

在多數樣品中 HKP 高豐度表達，導致上樣量內信號易飽和；

並非所有的細胞系或組織都會表達所需 HKP，即使表達，其表達量也會隨組織類型和細胞狀態發生改變；

在不同的處理條件下，如藥物刺激後，HKP 的表達量可能會發生變化；

HKP 表達水平會受到細胞密度的影響。

因此，在進行基於 HKP 的歸一化時，先決條件是確定不同實驗條件和樣品類型中 HKP 的表達恆定，還需要選擇和驗證合理的上樣量，讓靶蛋白和內參都處於線性範圍。

新晉標準——總蛋白歸一化

另一種方法是基於總蛋白的歸一化（Total Protein Normalization，TPN）。TPN 需要對膜上所有蛋白進行均勻染色或標記、成像和分析，即將整個泳道中的蛋白信號作為內參。

相較於 HKP 歸一化，TPN 不再依賴於單一蛋白的表達，可直接反應泳道間上樣量和轉膜效率的差異，線性範圍更廣，準確性和重複性更好，並節省了檢測 HKP 表達的時間、精力和試劑成本，現在已逐漸被視作蛋白印跡定量的金標準，在主流期刊對 WB 數據的要求中得到體現。

「For quantitative comparisons, appropriate reagents, controls and imaging methods with linear signal ranges should be used」 –Nature

「Normalize signal intensity to total protein loading (assessed by staining membranes for total protein) whenever possible」 –Journal of Biological Chemistry

「House-keeping proteins should not be used for normalization without evidence that manipulations do not affect expression」 –Journal of Biological Chemistry

TPN 中幾種總蛋白染色的方法各有優劣：

麗春紅是一種可逆、快速的染料，但是有靈敏度差和穩定性低的問題，容易在膜上留下自發螢光殘留物，所以不適用於螢光 WB；

考馬斯染料的靈敏度理想，不過需要平行運行兩塊膠，難以確保重複性；

如果使用可逆螢光染料，需要在流程中增加染色脫色的步驟和成像次數，增加了操作的複雜度，有些染料需要在 IR/NIR 通道下成像，也限制了成像儀的選擇；

使用免染技術可則省去染色脫色的步驟，但需要購買特殊的凝膠和搭配特定成像儀，並且需要在免疫印跡步驟前對總蛋白進行成像。

有沒有靈活簡單、既快又準的 TPN 方法

賽默飛通過 Invitrogen No-Stain 免染型蛋白標記試劑和 iBright 智能成像系統，可以讓 TPN 信號獲取更簡單，定量結果更準確、數據分析更容易。

使用方式靈活簡單

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No-Stain 試劑兼容任意凝膠類型以及 PVDF 和 NC 膜，適用於化學發光或螢光體系，可輕鬆融入現行 Western Blot 工作流程。標記操作也很簡單。混勻試劑後，對凝膠或轉印後的膜孵育 10 分鐘，即可完成標記。

使用 No-Stain 試劑標記蛋白印跡的步驟

No-Stain 染色的信號可使用帶有 UV、綠色 LED 、螢光光源（激發光範圍～455-485nm）的多種成像儀來捕獲，包括 iBright 系列成像系統。

定量結果更準確

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No-Stain 蛋白標記試劑可在更廣的線性檢測範圍內實現精準的 TPN，避免了 HKP 信號飽和導致的無效結果；可檢測到低至 20 ng 的蛋白條帶，信號靈敏穩定；未結合蛋白的標記物不會自發螢光，確保優越的信噪比。

使用 No-Stain 免染型蛋白標記試劑進行總蛋白歸一化。與 HKP 相比，在 HeLa 裂解物中使用 No-Stain 試劑進行歸一化的準確度更高

一鍵捕獲膜上靶蛋白和 TPN 信號

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iBright 系統通過內置「No-Stain」模塊和功能強勁的分析軟體，令圖像捕獲和歸一化分析更易上手。只需根據屏幕提示分配好通道，系統即可自動拍攝各通道的圖像並進行合併。

用各種試劑處理 HCT116 細胞後，WB 測定 p-AKT（Ser473）的相對含量，並用 No-Stain 試劑進行 TPN，在 iBright 上一鍵獲得 merge 圖像

直接計算歸一化因子

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歸一化因子和歸一化條帶數據可以直接在 iBright 系統上生成，並作為報告或原始數據導出，在電腦上進行數據處理（iBright 提供免費電腦版軟體）。

將歸一化處理的磷酸化-AKT 結果以誘導倍數形式呈現（處理組對比未處理組）

期望 Western Blot 技術經過效率和準確性的改善，能夠繼續伴隨我們探索蛋白奧秘。

這個差異是真實的麼？

是的，沒錯！