Cell Res:劉光慧等通過單鹼基基因編輯重塑超級幹細胞

從提高農作物的抗病能力，到原位編輯動物遺傳密碼，再到靶向摧毀發生基因突變的線粒體，乃至特異性矯正病人細胞中的致病基因突變，基因編輯技術的迅猛發展正在為人類的健康和生活帶來不同層面的改變。日前，中科院生物物理所劉光慧課題組、北京大學湯富酬課題組和中科院動物所曲靜課題組聯合開展的研究進一步拓展了基因編輯技術的應用範圍。研究人員利用基因編輯改寫了人類基因組遺傳密碼中的單個鹼基，首次在實驗室中獲得了遺傳增強的「超級」幹細胞（Genetically Enhanced Stem cells，GES細胞）。這種GES細胞能夠對細胞衰老和致瘤性轉化產生雙重抵抗作用，因此為開展安全有效的幹細胞治療提供了可能的解決途徑。該研究工作於2017年7月7日以「Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recoding」為題發表於Cell Research。

再生醫學領域存在兩個亟待解決的重要科學問題：（1）幹細胞治療的有效性，即如何獲得更多高質量的可供移植治療的人類幹細胞，如何賦予這些細胞移植物更強的自我更新、存活、定向分化以及對移植環境（如衰老與應激）的耐受能力，以便令其在體內發揮更為持久的治療效果。（2）幹細胞治療的安全性，即如何有效降低細胞移植物在體內形成腫瘤的風險。最新發表的這項研究工作聚焦於上述兩個重要問題，期望通過基因編輯手段對細胞內的關鍵基因和信號通路進行精確調控，從而同時實現幹細胞活力的提高及致瘤性的減弱，最終獲得優質安全的人類幹細胞移植物。

研究人員通過篩選可以延緩幹細胞衰老的小分子化合物，發現抗氧化轉錄因子NRF2的激動劑能延緩人類早衰症患者間充質幹細胞的加速衰老。在既往的低等模式生物研究中，NRF2的缺失會導致生物體壽命縮短，反之其過表達則有助於壽命的延長。而生物物理所研究團隊2016年發表在Cell上的文章和此項研究則進一步揭示人類間充質幹細胞的衰老伴隨著NRF2蛋白水平的顯著下調；反過來，NRF2的功能增強又能夠改善衰老間充質幹細胞的活力。因此，研究人員推測在編碼基因水平增強NRF2的活性或許能夠延緩人類幹細胞的衰老。為了證明這一點，他們利用第三代腺病毒載體HDAdV介導的基因編輯技術在人類胚胎幹細胞中置換了NRF2基因第2號外顯子中的單一核苷酸（A245G）。這一單鹼基置換使得細胞中的NRF2蛋白脫離了其抑制蛋白KEAP1的束縛，進而通過轉位至細胞核，激活一系列抗氧化和細胞保護基因的表達。

隨後，研究人員將基因編輯的人類胚胎幹細胞定向誘導分化成為具有治療潛力的間充質幹細胞，並發現這些間充質幹細胞的自我更新以及抵抗應激和細胞衰老等能力均獲得了顯著增強。此外，由該種胚胎幹細胞定向誘導分化而來的血管內皮細胞也表現出強大的抵禦氧化損傷的能力。這些結果均說明該遺傳增強策略能夠賦予人類幹細胞及其分化衍生物更強的活性和自我保護能力。

與此同時，研究人員還考察了GES細胞在經過體內移植之後是否也會具有更強的存活、整合和組織修復能力。研究結果表明，將上述GES細胞移植入小鼠體內後能夠表現出更強的存活和整合能力，並能夠顯著促進缺血損傷模型小鼠後肢血流的恢復，證明GES細胞在移植後能夠表現出優於普通幹細胞的再生修復能力。

圖1. 遺傳增強型人類間充質幹細胞抵抗細胞衰老，在連續傳代後仍可保持較低的衰老相關b-半乳糖苷酶活性及較長的端粒（上）；一系列NRF2下遊抗氧化和細胞保護基因的表達在遺傳增強型間充質幹細胞中協同上調（中）；遺傳增強型間充質幹細胞具有對小鼠後肢缺血損傷更好的治療作用（下）

研究人員也同時開展了針對遺傳增強策略的安全性評價，發現儘管GES細胞具有更強的自我更新能力和體外傳代壽命，但是在移植入免疫缺陷小鼠體內後並不會形成腫瘤。令人興奮的是，GES細胞還表現出對癌基因誘導的細胞惡性轉化的強抵抗作用。在諸多癌基因激活的情況下，GES細胞仍然保持著高度的基因組穩定性，移植入免疫缺陷小鼠體內後不會形成腫瘤。更有趣的是，經過遺傳增強的人類胚胎幹細胞在免疫缺陷小鼠體內僅能產生比對照胚胎幹細胞小得多的畸胎瘤。該實驗提示，即便GES細胞移植物中殘留了少量未分化的多能幹細胞，其在體內形成畸胎瘤的能力也已被大大削弱，這就進一步降低了利用遺傳增強型幹細胞進行細胞移植治療的安全風險。

圖2. 遺傳增強型人類間充質幹細胞對癌基因誘導的細胞惡性轉化具有強抵抗作用，仍然能夠維持基因組的穩定（上），移植入免疫缺陷小鼠體內後不會形成腫瘤（下左）；遺傳增強型人胚胎幹細胞僅能形成相對較小的畸胎瘤（下右）

綜上所述，該研究首次利用基因編輯技術實現了人類幹細胞的遺傳增強，並從概念上證明了利用該策略獲得優質安全細胞移植物的可行性。通過NRF2基因的單鹼基置換可以賦予人類幹細胞更強的抵禦應激和衰老的能力，以及在體內更好的留存和再生修復功能，甚至對幹細胞癌變的抵抗活性。該研究的意義不僅在於創造了一種優質安全的人類間充質幹細胞，更重要的是為針對不同組織類型及疾病特性設計不同遺傳增強方案的研究奠定了基礎，使得規模和標準化製備優質安全的人類細胞移植材料成為可能。

圖3. 利用基因編輯介導的遺傳增強策略獲得優質安全的人類幹細胞移植材料

據悉，該研究工作由中科院生物物理所、北京大學、中科院動物所和首都醫科大學宣武醫院等機構合作完成。中科院生物物理所劉光慧研究員、北京大學湯富酬研究員以及中科院動物所曲靜研究員為共同通訊作者。中科院生物物理所博士研究生楊濟平和北京大學博士研究生李靜宜為並列第一作者。

文章連結：

http://www.nature.com/cr/journal/vaop/ncurrent/full/cr201786a.html

劉光慧研究員簡介：

中科院生物物理研究所研究員，中國科學院大學崗位教授。國家傑出青年科學基金獲得者，幹細胞國家重大科學研究計劃（973）項目首席科學家。現任中國老年醫學學會基礎與轉化醫學分會副會長，中國老年醫學研究機構聯盟副主任委員，中國老年學和老年醫學學會抗衰老分會副主任委員，中國細胞生物學學會幹細胞生物學分會委員，中國生物物理學會理事，Protein &Cell雜誌副主編。近年來在基因編輯、幹細胞和衰老領域取得了系列原創性研究成果。回國後以通訊或共同通訊作者身份在Nature，Science，Cell，Cell Stem Cell, Cell Res和Nature Commun等雜誌發表系列研究論文。授權或申請發明專利（第一發明人）14項。獲首屆老年醫學傑出貢獻獎。

代表性研究成果

（1）利用誘導多能幹細胞（iPSC）技術闡明兒童早衰症患者血管細胞退行的分子機理（Nature 2011）

（2）利用HDAdV介導的基因編輯技術實現兒童早衰症患者iPSC中致病突變基因的靶向矯正（Cell Stem Cell 2011）

（3）利用全基因組測序證明HDAdV和TALEN兩種基因靶向矯正工具的安全性，並發展高效的基因編輯/矯正工具telHDAdV（Cell Stem Cell 2014）

（4）利用基因編輯技術建立人成年早衰症幹細胞模型，揭示異染色質高級結構失序在人類衰老中的驅動作用（Science 2015）

（5）揭示長壽基因SIRT6通過激活NRF2調節人幹細胞衰老和穩態的新機制（Cell Res 2016）

（6）利用基因編輯技術建立帕金森病的人類多能幹細胞模型，揭示帕金森病的神經幹細胞病變，發現幹預帕金森病神經幹細胞表型的候選化合物（Nature 2012）

（7）產生範可尼貧血症iPSC，利用基因編輯實現其致病基因靶向矯正，篩得改善範可尼貧血症造血前體細胞活力的候選化合物（Nat Commun 2014）

（8）利用基因編輯技術發展人類神經膠質母細胞瘤幹細胞模型，篩得可精準殺傷PTEN缺失膠質母細胞瘤幹細胞的候選化合物（Nat Commun 2015）

（9）利用基因編輯建立兒童早衰症幹細胞研究體系，揭示FDA批准的NRF2激動劑奧替普拉可抑制兒童早衰症幹細胞的加速衰老（Cell 2016）

（10）發展染色質三維動態成像工具TTALE，揭示核仁區rDNA重複序列的減損是人類衰老的新型分子標記物（Cell Res 2017）

（11）在漸凍人iPSC中實現SOD1和FUS基因的靶向矯正，揭示漸凍人運動神經元退行的早期分子標記物（Protein Cell 2017）

（12）利用基因編輯技術發展遺傳增強型人類幹細胞（GES細胞），使其同時獲得對細胞衰老、外界應激及瘤性轉化的抵抗（Cell Res 2017）

（生物谷Bioon.com）